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Spred2基因对人肝癌细胞凋亡的影响
目的 观察Spred2对人肝癌细胞(HepG2)凋亡的影响.方法 用阳离子脂质体瞬时转染 pcDNA3.0,pcDNA3.0-Spred2到HepG2细胞,建立过表达Spred2的细胞模型.膜联蛋白(annexin)Ⅴ-FITC /PI(7-AAD)双标通过流式细胞仪检测细胞凋亡;蛋白质印迹检测Spred2的表达水平.结果 转染Spred2基因能明显诱导HepG2细胞凋亡.另外,转染Spred2基因能显著地增强5-FU诱导HepG2细胞凋亡.结论 Spred2对人肝癌细胞凋亡有调控作用.
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人SPRED2基因重组腺病毒载体的制备及其对K562细胞ERK通路的影响
目的:构建携带SPRED2的质粒载体与重组腺病毒载体,并观察其在K562细胞的表达及对ERK信号通路的作用,为Spred2在造血细胞中的作用的研究奠定基础.方法:以HepG2细胞cDNA为模板,RT-PCR克隆SPRED2全长CDS序列,并亚克隆到pCDNA3.0和pshuttle-CMV质粒载体,构建携带SPRED2的真核表达载体pCDNA3.0-Spred2与穿梭载体pshuttle-CMV-Spred2;将线性化pshuttle-CMV-Spred2与腺病毒骨架质粒Adfl1p在感受态细胞BJ5183中进行同源重组,产生重组质粒Adfl1p-Spred2;后者经线性化后转染至HEK293细胞进行病毒包装；在HEK293细胞扩增病毒颗粒,以CsCl密度梯度离心法进行纯化,TCID50法测定病毒滴度；将病毒颗粒以100MOI感染K562细胞,Western blot检测Spred2过表达情况及Spred2对细胞ERK的影响.结果:经酶切、DNA测序、Western blot检测等方法鉴定,证明pCDNA3.0-Spred2与Adfl1 p-Spred2携带Spred2序列正确,能够在HEK293细胞、K562细胞正确表达,Spred2过表达能够显著抑制K562细胞ERK活性.结论:成功构建对K562细胞有高感染效率的SPRED2重组腺病毒载体,且Spred2对K562细胞ERK信号通路有显著抑制作用.
