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一种抗体药物偶联物中药物抗体偶联比的测定
用两种方法即液质联用和紫外分光光度法对一种抗体药物偶联物的药物抗体偶联比进行测定,为科学评价和有效控制药物抗体偶联比提供可靠方法.采用C4色谱柱及联用的质谱对去糖基化样品进行分析,根据偶联不同数目药物分子的质量数增加判断偶联数目；采用紫外分光光度计在252及280 nm处进行吸收度测量,根据抗体和药物在不同波长处的吸收系数不同,由二元一次方程求导出药物抗体偶联比.两种方法测得的药物抗体偶联比分别为3.21及3.25,结果相似,都可用于此种抗体药物偶联物的药物抗体偶联比分析.
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一种基于半胱氨酸偶联的抗体偶联药物的药物抗体偶联比测定
目的:建立了利用反相色谱(RP-HPLC)串联质谱对一种基于半胱氨酸偶联的抗体偶联药物(ADC)的药物抗体偶联比(DAR)进行测定的方法.方法:采用RP-HPLC方法,色谱柱为Varian公司的PLRP-S(50mm×2.1 mm,5μm,1 000 A);流动相A为50 mmol·L-1磷酸钠-1.5 mol·L-硫酸铵(pH 7.0);流动相B为75％ 50 mmol·L-1硫酸钠(pH 7.0)-25％异丙醇;梯度洗脱;柱温25℃;流速为0.8 mL·min-1;检测波长为280 nm.串联质谱对液相分离各组分进行定性分析.结果:所建立的RP-HPLC串联质谱分析方法可对各个峰组分进行定性定量,所测得的DAR为(4.0±0.1),标准差为2.5％.结论:基于PLRP-S色谱柱的RP-HPLC,无高浓度盐,不会对常规液相色谱系统造成污染,使用的是质谱兼容的流动相,能够兼顾质谱定性与液相定量,可用于基于半胱氨酸偶联的ADC的DAR测定.
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完整蛋白分子筛色谱串联质谱测定药物抗体偶联比
目的:建立完整蛋白分子筛色谱串联质谱分析方法对一种基于半胱氨酸偶联的抗体偶联药物(ADC)的药物抗体偶联比(DAR)进行测定.方法:采用PolyLC PHEA色谱柱,利用pH为7.0的200mmol· L-1乙酸铵溶液为流动相对脱糖样品进行脱盐,通过串联质谱对含有不同数目药物的ADC组分进行测定.结果:所测定的DAR为4.16±0.10,相对标准差为2.40％,且均能显示合不同数目药物的ADC组分的相对比例.结论:完整蛋白分子筛色谱串联质谱分析可确定ADC中含不同数目药物的组分并对各组分进行定量,可用于基于半胱氨酸偶联的ADC的DAR分析.
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抗体偶联药物抗HER2单抗-MCC-DM1质控方法的建立
目的:建立抗体偶联药物(ADC)抗人表皮生长因子受体-2(HER2)单抗-马来酰亚胺基-环己烷-1-羧化物(MCC)-美登素衍生物(DMn)(trastuzumab-DM1,T-DM1)的质控方法.方法:利用人乳腺癌BT-474细胞增殖抑制实验测定T-DM1的生物学活性;利用生物分子间相互作用分析核心技术(biomolecular interaction analysis core-technology,BIAcore)测定其结合常数(KD);利用HER2抗原和抗DM1抗体双夹心酶联免疫法(ELISA)对T-DM1进行鉴别;利用液质联用法和紫外分光光度法测定药物抗体偶联比(DAR);利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定游离药物DM1的含量;利用十二烷基磺酸钠-毛细管凝胶电泳(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate,CE-SDS)和分子排阻色谱(size exclusion-high performance liquid chromatography,SE-HPLC)分析纯度;利用成像毛细管等点聚焦电泳(iCIEF)分析电荷异质性,其他各项指标均符合现行版中国药典的要求及其他相关要求.结果:T-DM1 生物学活性相对效价为(94.04±2.60)％,KD为(1.03±0.02) E-9 mol·L-1,RSD均小于5％;ELISA鉴别为阳性;液质联用法和紫外分光光度法测得的DAR分别为3.21及3.25;RP-HPLC法测定游离药物DM1的含量为(0.822 2±0.050 5)％,RSD小于10％;非还原CE-SDS主峰面积为(96.63±0.07)％,RSD为0.07％;SE-HPLC主峰面积为(97.65±0.005 8)％,RSD为0.005 8％;iCIEF分析可以将每个偶联数的抗体药物分开,达到很好的鉴别.结论:建立ADC中T-DM1质控方法具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,为我国ADC的质量检测提供了参考依据.
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双波长分子排阻色谱测定半胱氨酸偶联—甲基澳瑞他汀E抗体药物偶联物的药物抗体偶联比
目的:建立双波长分子排阻色谱 (SEC) 测定抗体药物偶联物 (ADC) 的药物抗体偶联比 (DAR) 的方法.方法:采用凝胶色谱柱,柱温25℃,以0.1 mol·L-1磷酸盐-0.1 mol·L-1氯化钠缓冲液为流动相对100μg样品进行等度洗脱,流速1.0 mL·min-1,在248 nm及280 nm双波长下分别对ADC的小分子药物和抗体进行检测;采用紫外分光光度计在248 nm及280 nm处进行吸收度测量.结果:双波长SEC可准确地对ADC的DAR进行测定,测得的DAR为4.17,RSD为0.24％;紫外分光光度 (UV) 法测得的DAR为3.97,RSD为2.8％.结论:双波长SEC检测可用于ADC样品的DAR测定,同时可对样品的大小异构体进行分析.SEC及UV 2种方法测得的DAR结果相似,都可用于ADC的药物抗体偶联比分析.
