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DoE实验设计开发23价肺炎多糖疫苗层析纯化平台工艺
目的:应用DoE实验设计,建立一种新型23价肺炎多糖疫苗层析纯化工艺平台.方法:将23F型肺炎粗糖样品作为开发样品溶解并预处理后,采用DoE设计开发基于Capto Adhere的纯化工艺.色谱纯化过程采用流穿模式,通过DoE分析获得工艺参数,在该条件下将多糖和其他杂质分离,并作为纯化平台应用于其他血清型多糖.根据《欧洲药典》7.0的方法和标准,对样品的各项指标进行检测.结果:23F型多糖在柱上流穿,多糖与蛋白和核酸完全分离,应用此工艺平台至其他血清型多糖上,纯化的多糖样品各项指标也均符合《欧洲药典》7.0的标准.结论:通过DoE实验设计快速建立了一种新型肺炎多糖疫苗层析纯化工艺平台,缩短生产时间,提高产品质量,代替传统的有毒苯酚抽提工艺,可用于23价肺炎多糖纯化和23价肺炎多糖疫苗生产.
关键词： 肺炎多糖 层析 Capto Adhere 疫苗 DoE -
采用DoE设计方法优化可溶性肿瘤坏死因子Ⅰ型受体蛋白的聚乙二醇修饰工艺
目的 采用DoE设计方法对人可溶性肿瘤坏死因子Ⅰ型受体(soluble tumour necrosis factor αreceptors Ⅰ,sTNFα-RⅠ)的聚乙二醇(PEG)修饰工艺参数进行优化,以期获得稳定、可控的工艺参数.方法 采用UNICORN(DoE)软件中Central Composite Face Centered(CCF)模型对sTNFα-RⅠ的3个PEG修饰工艺参数,即溶液pH值(pH)、反应时间(Time)和PEG与蛋白质量比(PEGrate)进行优化,设置4个响应值(多PEG修饰蛋白峰面积、单PEG修饰蛋白峰面积、未修饰蛋白峰面积及单PEG修饰蛋白峰面积与多PEG修饰蛋白峰面积比值)揭示其化学反应过程,确定参数操作空间;应用蒙特-卡罗模拟法(Monte-Carlo Simulation)对优化参数进行风险评估.结果 3因子17组试验结果的重复性较好,中心点重复组响应值介于低值和高值之间,且随机分布,符合DoE试验设计的要求;4个响应值所对应的回归系数(R2)均＞0.75,预测准确性(Q2)＞0.5,模型有效性(Model Validity)＞0.25,重复性(Reproducibility)＞0.5,模型预测与实验值之间偏差较小,具有可靠的预测准确性;17组试验结果标准残差在允许范围(-4～4)之间,线性较好,预测值与观测值之间相关性较好,建立的模型拟合度高,可较为准确地预测试验结果.溶液pH值对多PEG修饰产量影响较小,随着Time和PEGrate的升高,多PEG修饰产物增加,单PEG修饰产物经二次或多次修饰形成多PEG修饰产物,减少Time和PEG用量可减少多PEG修饰产物;单PEG修饰产物随着pH上升,产量有所增加,与Time呈二次项关系,在Time· PEGrate交互作用中,减少PEG用量可增加单PEG修饰产物量;减少Time和降低PEG用量可提高单PEG修饰产物与多PEG修饰产物的比值,有利于下游纯化.确定了工艺参数的操作空间,当pH为5.5时,反应时间控制在30 h以上,PEG与蛋白质量比控制在3.7以下,符合预设值;pH在6.5时,反应时间控制在22～35 h之间,PEG与蛋白质量比控制在2.5 ～4.0之间,符合预设值;蒙特-卡罗模拟法对在佳操作参数(反应时间34.1h,溶液pH值6.5,PEG与蛋白质量比2.5)时模型预测的响应值(单PEG修饰产物峰面积值5 635.82和单PEG修饰产物与多PEG修饰产物比值3.226 5)的风险评估,10万次模拟试验可信度分别为99.825％和99.982％,试验风险较小,工艺可控.结论 确定了sTNFd-R Ⅰ蛋白PEG修饰稳健的工艺参数.
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干扰素α-2a的复性DOE研究
通过DOE(Design of experiment)的方法研究干扰素α-2a(IFN α-2a)蛋白的复性条件,以获得适宜的工业生产条件.以包涵体(Inclusion body,IB)形式在大肠杆菌体内表达的干扰素α-2a蛋白,经过变性、复性后折叠形成天然结构的活性蛋白.通过稀释复性的方法,并对复性液的pH、精氨酸浓度及复性时间进行DOE设计和考察,获得了上述复性参数的工艺范围:复性时间50 ～60 h,pH (9.9±0.1),精氨酸浓度0.3～0.5 mol/L.复性率为35％ ～42％,19 min杂质(峰后)小于15％.终结果表明,精氨酸能有效抑制复性过程中蛋白质的聚集,提高干扰素α-2a折叠效率;从而提高产品收率及该产品的经济效益;pH值的合理选择和复性时间的有效延长可降低19 min杂质含量,进而降低纯化成本.
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采用DOE试验方法优化重组人干扰素α2a纯化工艺
目的 采用DOE试验方法对重组人干扰素α2a纯化工艺参数进行优化,并寻找各参数的操作空间,为实际的产品生产提供指导.方法 利用DOE中的中心符合表面设计(CCF)模型,设置两个响应值目标蛋白纯度和得率,对重组人干扰素α2a纯化工艺的疏水层析精纯进行优化并找出操作空间.选取两个工艺参数,即洗脱液B的(NH4)2SO4浓度(0.60M·L-1~0.70M·L-1)和洗脱液C的(NH4)2SO4浓度(0.30M·L-1~0.40M·L-1).结果 从模型的线性、正确性、有效性和重复性判断,所建立的模型拟合度高,可较为准确的预测实验结果.其中,洗脱液B的(NH4)2SO4浓度、洗脱液C的(NH4)2SO4浓度以及各自的平方对响应值有显著影响.同时,利用sweet spot找出关键层析步骤的操作空间.
