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Bac to Bac昆虫杆状病毒表达系统文献资料
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激活素受体样激酶4,5和7抑制剂体外高通量筛选模型的构建
目的 构建适于高通量筛选的激活素受体样激酶4(ALK4),ALK5和ALK7抑制剂的筛选模型.方法 利用Bac to Bac昆虫杆状病毒表达系统,构建ALK4激酶结构域(ALK4kd),ALK5kd和ALK7kd及Smad2和Smad3蛋白的病毒表达系统,转染Sf9昆虫细胞,表达目的蛋白;通过谷胱甘肽S-转移酶(GST)亲和柱纯化,获得纯化的目的蛋白;分别以纯化的ALK4,ALK5,ALK7激酶片段与纯化的Smad3和ATP构建ALK4,ALK5,ALK7激酶活性测定体系,优化各反应底物浓度及反应条件,建立适于通量化分析的筛选模型;以已知ALK激酶抑制剂SB431542为工具分子,检测其对激酶的抑制活性,确证筛选模型的可靠性.结果 经酶切和PCR鉴定,所得重组Bacmid均正确.转染Sf9昆虫细胞后纯化获得相应目的蛋白.经条件优化,反应体系中激酶和底物蛋白Smad3佳浓度均为10 mg·L-1,ATP佳初始浓度为10 nmol·L-1.所得ALK4,ALK5和ALK7激酶抑制剂筛选体系的Z’因子分别为0.71,0.51和0.74,符合高通量筛选要求.已知SB431542在所建模型上对ALK4kd,ALK5kd和ALK7kd的抑制活性IC50值分别为22,188和91 nmol·L-1.结论 成功构建了ALK4,ALK5和ALK7激酶抑制剂的体外筛选模型.
