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实时荧光定量核酸扩增文献资料
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一种磁珠提取结合实时荧光定量核酸扩增定量检测重组人血白蛋白中毕赤酵母DNA残留方法的建立
目的 探索利用磁珠提取法结合实时荧光定量核酸扩增技术,建立定量测定毕赤酵母来源重组人血白蛋白中残留DNA的方法.方法 将蛋白裂解后采用磁珠提取法提取样品中的残留DNA,利用Taqman探针法对样品和DNA标准品进行定量PCR测定,根据标准曲线对样品中的DNA残留量进行分析.采用重组人血白蛋白和血浆来源人血白蛋白2种基质对建立的方法进行回收率和重复性测定,评价方法准确性及精密度,并测定毕赤酵母来源重组人血白蛋白产品中残留DNA含量.结果 该方法测定毕赤酵母DNA残留低准确定量浓度为3fg· μL-1,DNA含量在3 fg· μL-1 ～300pg· μL-1内曲线线性良好,标准曲线相关系数r2为0.998 3;以重组人血白蛋白作为基质时,100和10fg·μL-1 DNA加标回收率均值分别为93.58％(n=4)和215.56％(n=4);相对标准偏差RSD分别为19.6％及42.9％;以人血白蛋白作为基质时,100和10 fg·μL-1DNA加标回收率均值分别为67.09％(n=3)和113.40％(n=3);相对标准偏差RSD分别为6.9％和11.1％.按该方法检测毕赤酵母来源的3批重组人血白蛋白DNA残留量均值(n=7)分别为5.98、4.16和4.49 fg·μL-1 (n =7);3批样品DNA残留量均小于1ng· 10 g(Pro)-1.结论 磁珠分离法结合荧光定量PCR方法可解决超高蛋白浓度背景下重组人血白蛋白痕迹量DNA定量测定的技术难题,准确性和重现性良好,可以用于重组人血白蛋白毕赤酵母DNA残留量的定量检测.
