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嗜铬颗粒蛋白B与热休克同源蛋白70相互作用的研究
目的分离和鉴别在肾上腺髓质嗜铬颗粒细胞分泌囊泡中,与嗜铬颗粒蛋白B(CgB)相互作用的蛋白质.方法采用蛋白质捕获、免疫共沉淀和质谱等技术进行研究.结果在嗜铬颗粒细胞内,CgB与热休克同源蛋白70(Hsc70)相互作用.一个Hsc70结合序列定位在CgB的羧基末端区(Ser586-Arg602,SR-17),而且SR-17内的Ser595磷酸化可增强其与Hsc70结合.磷酸化修饰的SR-17可从ATP-Sepharose上洗脱Hsc70.用免疫印迹和免疫组化方法可证实CgB和Hsc70均存在于嗜铬颗粒细胞的胞质和细胞核中.结论 Hsc70可能参与CgB的细胞核转位过程.
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嗜铬颗粒蛋白B-GST融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达
目的构建小鼠嗜铬颗粒蛋白B(chromogranm B,CgB)重组原核表达载体.方法先用RT-PCR方法从小鼠脑基因组中扩增出CgB基因cDNA序列,应用T-A克隆技术,克隆到质粒pMD-T vector,经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1中进行表达.结果表达产物经Western Blot分析,在140处有一明显特异带,与预期结果相符.结论构建重组融合表达载体pGEX-CgB,在原核细胞中成功表达出小鼠CgB-GST融合蛋白.