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乙型肝炎相关性肝癌患者血清低拷贝HBV DNA检测的临床分析
目的 通过对乙型肝炎相关性肝癌(HCC)患者血清低拷贝HBV DNA的检测,探讨乙肝病毒低复制水平与肝癌发生、发展的相关性,明确乙型肝炎患者血清低拷贝HBV DNA检测的临床意义.方法 在所有乙型肝炎相关性HCC患者中,选取85例血清HBV DNA水平持续小于1 000 IU/ml的患者,对其病情发生、发展、演变进行系统的回顾分析,同时获得其血清,进行乙型肝炎标志物、肝功能、甲胎蛋白及低拷贝HBV DNA的检测,后分析各项指标与低拷贝HBV DNA的相关性,分析其临床意义.结果 85例乙型肝炎相关性HCC患者当中,乙型肝炎标志物HBeAg阳性者有15例,占17.65％,HBeAg阴性者70例,占82.35％.肝功能指标(ALT及AST)异常者52例,占61.18％.甲胎蛋白(AFP)异常升高者65例,占76.47％.低拷贝HBV DNA水平大于20 IU/ml者72例,占84.71％.低拷贝HBV DNA水平小于20 IU/ml者13例,占15.29％.结论 乙型肝炎相关性HCC与乙型肝炎病毒持续复制有关,常规的HBV DNA检测只能检测HBV DNA水平大于1 000 IU/ml的患者,乙肝病毒低复制患者往往会被忽视,导致患者不能及时抗病毒治疗而使得病情发展.因此这种检测已不能满足临床的实际要求,乙型肝炎患者低拷贝HBV DNA检测更有临床指导意义.
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ART-PCR方法的建立及扩增低拷贝RNA的初步研究
建立依赖反义RNA和核糖核酸酶T1(RNase T1)的PCR方法,称为ART-PCR,用于扩增高拷贝RNA和复杂RNA样本中的低拷贝RNA.首先,设计待检低拷贝RNA的反义RNA分子,在高拷贝和复杂RNA样本中与待检低拷贝RNA退火后用RNase T1消化,反转录后用PCR扩增.进一步,用ARPE-19细胞中低表达基因干扰素γ(IFNG)作为实例,用ART-PCR和常规实时定量PCR(RT-qPCR)检测.结果显示,用ART-PCR可以很好地消除常规RT-qPCR中低拷贝RNA的PCR抑制效应.研究结果初步表明ART-PCR可以作为检测低拷贝RNA的理想工具,这对于RNA功能的基础研究以及基于多重PCR的临床复合病毒感染的基因诊断方法的优化、推广具有重要的参考价值.
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低拷贝HBV病毒全长DNA的制备和体外复制水平的鉴定
目的:从乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)低拷贝的血清样本中提取病毒DNA并通过PCR扩增得到全长DNA片段.将全长片段经过环化处理后转染HuH7细胞,体外评价病毒的复制水平.方法:设计含有BspQ I酶切位点的HBV全长扩增引物和分段扩增引物,选择HBV低拷贝的临床病人血清样本,经抽提纯化后的病毒DNA作为模板,用巢式PCR结合分段扩增的方法扩增得到HBV全长DNA,PCR产物经BspQ I酶切后自连环化,将环化的HBV DNA转染HuH 7细胞,经5d细胞培养,提取细胞中的病毒复制中间体,通过Southern blot分析病毒复制水平.结果:通过PCR扩增得到5个HBV全长DNA,经过酶切连接全长基因后转染HuH7细胞,Southern blot检测均有复制表达.结论:本实验成功构建能够有复制表达的HBV环化全长,为研究血清中低拷贝HBV病毒的不同病人复制水平与DNA序列关系打下基础.
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巢氏PCR扩增低拷贝HBV全基因组方法的建立及应用
目的 建立一种用于低拷贝乙型肝炎病毒(HBV)不同基因型全基因组扩增的巢式聚合酶链式反应(nested PCR)方法及应用评价.方法 通过设计和改良一组对HBV各基因型(A,B,C,D,E,F,G) DNA均具有较高扩增效率的通用巢式简并引物,采用两步法分六段(Ⅰa,Ⅰb,Ⅱa,Ⅱb,Ⅲ,Ⅳ)扩增低拷贝HBV基因组,比较不同反应条件对于PCR扩增产物的影响(退火温度,引物浓度),建立一种适合于低拷贝HBV全基因组扩增的方法;同时采用该方法对57份低浓度HB-sAg乙肝感染者(HBsAg＜10IU/ml)的全基因组进行扩增、测序、拼接并进行评价.结果 该方法的灵敏度可达25IU/ml,重复性好,对57份低浓度HBsAg乙肝感染者进行扩增,其中全基因扩增49例(86.0％),各片段(Ⅰa,Ⅰb,Ⅱa,Ⅱb,Ⅲ,Ⅳ)扩增分别为:53例(93.0％),52例(91.2％),54例(94.7％),54例(94.7％),55例(96.5％)和49例(86.0％),说明该方法适用于慢性低浓度HBsAg乙肝感染者HBV DNA全基因扩增.结论 该文为慢性低浓度HBsAg乙肝感染者的全基因系列分析提供了高灵敏度、高特异度的方法,可在低浓度HBsAg感染者流行病学调查中发挥重要作用,同时为巢氏PCR扩增反应体系的优化提供了参考.
