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中华按蚊热激蛋白40(HSP40)cDNA序列的全长扩增
目的 为获取中华按蚊感染约氏疟原虫后24 h的高表达基因热激蛋白40(HSP40)cDNA的全长序列. 方法 运用抑制性消减杂交技术(suppression substractive hybridization,SSH)构建中华按蚊感染约氏疟原虫后24 h的差异表达基因文库,从高表达文库中获得长度为363 bp的HSP40基因的cDNA片段,运用RACE技术对其cDNA序列进行全长扩增. 结果 获得中华按蚊HSP40 cDNA的全长序列,总长度为1 159 bp,开放阅读框为1 014 bp,编码337个氨基酸. 结论 获得了中华按蚊HSP40 cDNA的全长序列.
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MicroRNA-A6增效的HEV体外瞬时转染HepG2复制体系的建立及鉴定
目的 验证HEV编码的MicroRNA-A6对全长HEV瞬转HepG2细胞系中病毒复制的增效作用.方法 按照已报道序列合成miR-A6,利用重组PCR、基因克隆以及体外转录技术获得单一高浓度的HEV RNA.HEV RNA与miR-A6按比例采用脉冲电流转染HepG2细胞,转染后24、48和96h后观察细胞上清IgG分泌和HEV RNA表达载量,与不加miR-A6的HepG2细胞进行比较,分析miR-A6对HEV复制的作用,然后加入anti A6抑制miR-A6表达,分析其对HEV表达和复制的影响.结果 MiR A6∶HEV RNA质量比为0.5∶1和1∶1,共转染HepG2细胞后48 h,与单转染HEV RNA相比,lg值升高了1.57和2.44.HEV-IgG先于HEVRNA表达.体外实验显示,Ⅰ型和Ⅳ型HEV复制力没有明显差别,都在转染后48 h达到峰值,加入anti A6抑制miR-A6后HEV-IgG抑制47.12％,HEV RNA抑制43.3％.结论 MiR-A6可以在体外显著增加HEV RNA瞬转HepG2细胞系中HEV病毒的复制力,为后续HEV分子病毒学和表型耐药研究奠定基础.
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一种全长扩增克隆HEV方法和HEV体外瞬时转染体系的建立
目的 建立HEV全长基因组扩增克隆和全长HEV RNA体外瞬时转染细胞方法和初步应用.方法 取5例抗HEV IgG阳性患者血清,采用特异性引物逆转录HEV RNA为eDNA,设计通用的分段且相互重叠的PCR引物分步扩增,然后再分别将PCR产物进行重组PCR扩增,终获得全长的HEV RNA cDNA产物片段.测序确定其序列,采用T-A克隆全长HEV cDNA序列,将HEV全长cDNA序列进行体外转录,提取转录后产物的RNA(去除DNA模板),获得高水平的HEV RNA产物,采用脉冲电流转染HepG2细胞,转染后24 h、48 h和96 h观察细胞上清HEV抗原分泌和HEV RNA载量.结果 自GenBank获得约300条HEV全长基因组序列,设计了分段重组PCR方法,快速获得了HEV基因组全长序列;T-A克隆HEV全长基因组测序分析其序列,体外转录制备高纯度的HEV mRNA,通过电转方式转入HepG2细胞,在较短时间内检测出HEV RNA,有效地评价了HEV的体外表型.HEV抗原要先于HEV RNA出现;体外实验显示I型和IV型HEV复制能力无明显差别,都在转染后48 h达到峰值.结论 建立的分段重组PCR法扩增HEV全长基因组,体外电转细胞系后分泌HEV RNA,为后续HEV分子病毒学和表型耐药研究提供了条件.
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低拷贝HBV病毒全长DNA的制备和体外复制水平的鉴定
目的:从乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)低拷贝的血清样本中提取病毒DNA并通过PCR扩增得到全长DNA片段.将全长片段经过环化处理后转染HuH7细胞,体外评价病毒的复制水平.方法:设计含有BspQ I酶切位点的HBV全长扩增引物和分段扩增引物,选择HBV低拷贝的临床病人血清样本,经抽提纯化后的病毒DNA作为模板,用巢式PCR结合分段扩增的方法扩增得到HBV全长DNA,PCR产物经BspQ I酶切后自连环化,将环化的HBV DNA转染HuH 7细胞,经5d细胞培养,提取细胞中的病毒复制中间体,通过Southern blot分析病毒复制水平.结果:通过PCR扩增得到5个HBV全长DNA,经过酶切连接全长基因后转染HuH7细胞,Southern blot检测均有复制表达.结论:本实验成功构建能够有复制表达的HBV环化全长,为研究血清中低拷贝HBV病毒的不同病人复制水平与DNA序列关系打下基础.
