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14-3-3β蛋白介导胰高血糖素作用下糖异生的特点及机制
目的 分别观察胰高血糖素在空质粒转染组和14-3-3β蛋白过表达组对HepG2细胞糖异生的影响,并对14-3-3β蛋白介导此现象出现的可能原因初步探讨.方法 对转染空质粒或14-3-3β质粒低糖培养基培养的HepG2细胞分别在有无胰高血糖素作用下,进行培养基中葡萄糖产量的测定并观察糖异生关键酶蛋白表达量的变化;用免疫共沉淀的方法判定稳定转染胰高血糖素受体的293细胞在胰高血糖素对待下,14-3-3β蛋白与胰高血糖素受体结合的变化.结果 在未加及加入胰高血糖素对待下,14-3-3β转染组与空质粒对照组相比葡萄糖产量降低(P均＜0.05);糖异生关键酶表达量降低(P均＜0.05);免疫共沉淀显示胰高血糖素受体、14-3-3β蛋白与碳水化合物反应元件三者处于结合状态,且在胰高血糖素作用下14-3-3β蛋白与胰高血糖素受体结合减少而与碳水化合物反应元件结合增多(P均＜0.05).结论 过表达14-3-3β蛋白可起到抑制胰高血糖素的糖异生作用且这种现象发生的原因可能与其同碳水化合物反应元件间的相互作用及产生的后续效应有关.
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胰高血糖素受体拮抗剂筛选模型的建立
目的:研究胰高血糖素受体(GR)拮抗剂筛选模型的建立.方法:用离心法提取大鼠肝脏GR,以125I标记的胰高血糖素(125I-Glucagon)为配体,利用放射性配体结合分析法,检测配体与GR的饱和性结合特征及14个化合物的竞争性结合能力.为进一步研究GR拮抗剂的筛选方法,将含有GR目的基因Pmt 5.1 cDNA短暂转染在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)上,加入钙离子敏感性荧光染料(Fluo-3),通过检测荧光强度的改变,筛选GR拮抗剂.结果:竞争结合实验证明125I-Glucagon与GR结合良好,其平衡解离常数kd值为9.38 nmol·L-1,受体大容量Bmax为4.33nmol·L-1;14个化合物中有4个化合物(ZM102849、ZM102850、ZM102854和ZM102855)与GR结合良好.CHO细胞表达GR后,对4个与GR结合良好的化合物进行细胞水平实验,结果表明化合物ZM102850可以引起荧光强度明显降低,具有拮抗GR的作用.结论:通过放射性配基结合实验方法和荧光强度检测法可以筛选GR拮抗剂.
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胰高血糖素受体siRNA对糖尿病模型小鼠的降糖作用研究
目的:设计合成胰高血糖素受体(GCGR)基因的siRNA序列,并考察其对糖尿病模型小鼠的降糖作用.方法:根据siRNA设计原理设计了3条靶向GCGR的siRNA序列(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3).在建立了糖尿病模型小鼠以及血糖检测方法的基础上,检测一次性高压快速静脉注射给药后连续8d的血糖含量,以及给药后第2天腹腔注射葡萄糖后30、60、90、120min时血糖含量,并计算AUC值(糖耐量测试);同时设立非靶向siRNA组为对照.结果:3条靶向性siRNA给药后第1天小鼠血糖含量即明显下降,之后虽有所回升,但是与给药前比较仍有降低,而对照组则未出现血糖降低的现象,反而有所升高;在糖耐量试验中,siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3序列组及对照组AUC分别为964.5、3 216.1、2 606.9、4 173.9 min·mmol·L~(-1),前3组对葡萄糖的生物利用度显著更高.结论:设计合成的3条靶向GCGR的siRNA序列经静脉注射给药后,可较为有效地改善模型小鼠的高血糖症状.
