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下调PALM3表达抑制脂多糖诱导的巨噬细胞炎性反应
目的 探讨抑制paralemmin-3(PALM3)表达对脂多糖(LPS)诱导的大鼠肺泡巨噬细胞系(NR8383)炎性反应的影响.方法 将NR8383细胞并接种至6孔板中,待融合度达70％,加入0.5μg/ml LPS刺激12h,用免疫荧光检测细胞PALM3表达及亚定位;用0.5μg/ml LPS刺激NR8383细胞并在0、3、6、12、24和48h收集细胞提取总RNA,用RT-PCR法检测PALM3 mR-NA;同前接种细胞至24孔板,待融合度达70％,将PALM3小干扰核糖核苷酸(siRNA)转染NR8383细胞(PALM3 siRNA转染组),同时设立正常NR8383细胞组和对照转染组(转染control siRNA),转染48h后,提细胞总蛋白用Western blot法检测PALM3蛋白水平a3组细胞给予LPS刺激12h,收集培养上清和核蛋白,用ELISA法检测培养上清中IL-8、IL-6的水平及核转录因子(NF-κB)转录活性.结果 PALM3分子在NR8383细胞中有表达,LPS可诱导PALM3表达;PALM3 siRNA转染后成功下调PALM3蛋白表达,予LPS刺激后,与正常细胞及对照转染组比较,PALM3 siRNA转染组培养上清中白介素-8(IL-8)和IL-6含量减少,PALM3 siRNA转染组细胞中NF-κB转录活性亦被抑制.结论 NR8383细胞中有PALM3表达,LPS可诱导NR8383细胞中PALM3的蛋白表达,下调PALM3表达可抑制LPS诱导的炎性反应.
关键词： Paralemmin-3 脂多糖 巨噬细胞 炎症 -
姜黄素对脂多糖诱导的巨噬细胞炎症与氧化应激的影响及机制
目的 探讨姜黄素对脂多糖(LPS)诱导的大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)炎症反应和氧化应激的影响及机制.方法 NR8383细胞分正常细胞组、LPS组(仅LPS刺激)及姜黄素预处理组[用姜黄素(5、10、15、20、25μmol/L)预处理1 h后,再加入0.5μg/mL LPS刺激NR8383细胞],用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法测细胞活性;舍弃细胞毒性大的姜黄素浓度组,用酶联免疫吸附实验(ELISA)法测培养上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)含量、用流式细胞仪测细胞内活性氧簇(ROS)水平、WST-8法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性;15μmol/L姜黄素预处理细胞,同前LPS刺激细胞,提取细胞总蛋白,蛋白质印迹法(Western blot)法测paralemmin-3(PALM3)蛋白表达.结果 与正常细胞组相比,0.5μg/mL LPS及5～20μmol/L姜黄素+0.5μg/mL LPS对细胞活性无影响(P>0.05);25μmol/L姜黄素+0.5μg/mL LPS有细胞毒性(P<0.05).5～20μmol/L姜黄素可抑制LPS诱导的TNF-α、IL-1β及ROS的产生,提高胞内SOD活性,并呈剂量依赖性(P<0.05);其中15μmol/L与20μmol/L姜黄素的抑制效力相似(P>0.05).LPS上调NR8383细胞内PALM3蛋白水平,15μmol/L姜黄素抑制LPS诱导的PALM3表达上调(P<0.05).结论 姜黄素可抑制LPS诱导的大鼠肺泡巨噬细胞炎症反应和氧化应激,抑制LPS诱导的PALM3高表达是可能的分子机制之一.
关键词： 姜黄素 脂多糖 肺泡巨噬细胞 Paralemmin-3 -
干扰 PALM3表达对小鼠内毒素性急性肺损伤的影响
目的：研究干扰paralemmin －3（PALM3）表达对小鼠内毒素（LPS）性急性肺损伤（ALI）的影响。方法雄性BALB／c小鼠30只，随机分成3组：正常小鼠组、PALM3 shRNA组（在体转染PALM3 shRNA质粒）及Control shRNA组（在体转染Control shRNA质粒）。转染48 h后，免疫组化及逆转录聚合酶链反应（ RT－PCR）检测肺内PALM3表达水平，检验PALM3 shRNA的干扰效率。雄性BALB／c小鼠40只，随机分4组：正常小鼠组、ALI模型组、PALM3 shRNA＋ALI组及Control shRNA＋ALI组，腹腔注射LPS（15 mg／kg）4 h后处死小鼠，观察各组肺组织病理学改变及肺组织匀浆中NO含量、MPO活性。结果与正常小鼠组及Control shRNA组比较，PALM3 shRNA组肺内PALM3表达下调（P＜0.05）。注射LPS后，与正常小鼠组比较，ALI模型组及Control shRNA＋ALI组小鼠出现典型ALI病理改变，肺损伤评分升高（ P＜0.05），肺组织匀浆中NO含量及MPO活性增加（ P＜0.05）；与ALI模型组及Control shRNA＋ALI组比较，PALM3 shRNA＋ALI组小鼠肺损伤程度减轻（ P＜0.05），肺组织匀浆中NO含量及MPO活性下降（P＜0.05）。结论经滴鼻方式转染PALM3 shRNA质粒，成功下调PALM3在小鼠肺内的表达；干扰小鼠肺内PALM3表达可减轻LPS性ALI程度及炎性反应。
关键词： 急性肺损伤 内毒素 Paralemmin-3 小发夹核糖核酸 炎性反应 -
靶向大鼠PALM3基因的RNA重组腺病毒载体构建及鉴定
目的 构建靶向大鼠pa ralemmin-3 (PALM3)基因的短发夹shRNA(RNA)重组腺病毒载体,干扰大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AE2 cells)中PALM3的表达.方法 设计大鼠靶向PALM3基因的shRNA,插入穿梭质粒pGV120-EGFP,行PCR、测序鉴定;将穿梭质粒和骨架质粒共转293细胞,进行重组腺病毒Ad-palm3-shRNA-EGFP的包装,并采用TCID50法测定病毒感染滴度;用此病毒感染大鼠AE2细胞,Western blot法检测细胞内PALM3蛋白表达.结果 穿梭质粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP经PCR及测序鉴定证实构建成功,进一步构建了表达大鼠PALM3基因shRNA的重组腺病毒载体Ad-palm3-shRNA-EGFP,重组腺病毒感染滴度为3×1010 pfu/mL,感染大鼠AE2细胞后显著抑制目的蛋白表达(P＜0.05).结论 本实验成功构建了针对大鼠PALM3基因的shRNA重组腺病毒,显著下调了大鼠AE2细胞中PALM3的表达,为进一步探索PALM3在炎性失控性疾病中的作用奠定基础.
关键词： 短发夹RNA Paralemmin-3 重组腺病毒载体 RNA干扰 急性肺损伤 -
干扰paralemmin-3表达抑制脂多糖诱导的肺泡上皮细胞的炎性反应
目的 探讨干扰paralemmin-3 (PALM3)表达对脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮A549细胞炎性反应的影响.方法 实验分为正常细胞组(未转染)、对照转染组(转染control siRNA)及PALM3 siRNA转染组(转染针对PALM3的小干扰核糖核苷酸siRNA)三组;采用Western-blot法测PALM3蛋白表达水平,检验PALM3 siRNA的干扰效率.三组细胞同时给予LPS刺激12 h后,收集细胞培养上清液和总蛋白,ELISA法检测各组细胞培养上清中的TNF-α、IL-1β含量,同时用Western-blot法检测各组细胞中单免疫球蛋白白介素-1受体相关蛋白(SIGIRR)表达水平.结果 特异性siRNA转染后成功干扰了PALM3在A549细胞中的表达;给予LPS刺激后,与正常细胞组及对照转染组相比,PALM3 siRNA转染组细胞培养上清中TNF-α、IL-1β水平显著下降,同时PALM3 siRNA转染组细胞中SI-GIRR的表达上调.结论 干扰PALM3的表达可减轻A549细胞对LPS诱导的炎性反应,其可能机制是通过上调Toll样受体/白介素-1受体(TIR)负调控分子SIGIRR的表达来实现的.
关键词： Paralemmin-3 脂多糖 肺泡上皮细胞 RNA干涉 炎症
