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大鼠Pig-a基因突变试验中N-乙基-N-亚硝基脲和环磷酰胺量-效关系的优化
目的 研究不同剂量的N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)和环磷酰胺(CP)对SD大鼠外周血红细胞表面锚蛋白CD59缺失率的影响,优化Pig-a基因突变试验检测方法.方法 将SD大鼠按体重和外周血RBCCD59-随机分为4组,即溶媒对照组,CP 40 mg/kg给药组,ENU 10 mg/kg给药组和ENU 40 mg/kg给药组,每组6只,腹腔染毒,溶媒对照组注射 PBS 溶液.在染毒前和染毒后7、14、21、28、42、56 d 进行称重和采血,流式检测外周血RBCCD59-发生率.结果 与溶媒对照组比较,ENU 10 mg/kg给药组和ENU 40 mg/kg给药组各时间点体重及体重增量差异均无显著性,CP 40 mg/kg给药组各时间点体重及体重增量均下降(P < 0.05).CP 40 mg/kg给药组给药后第28、42和56天,ENU 10 mg/kg给药组给药后第42、56天,ENU 40 mg/kg给药组给药后第7、14、21、28、42和56天外周血RBCCD59-发生率均升高(P < 0.05),且具有剂量反应关系.结论 在开展Pig-a基因突变试验中, ENU引起大鼠外周血RBCCD59-发生率升高效果优于CP,且40 mg/kg剂量优于10 mg/kg,检验周期28 d为宜.
关键词： Pig-a基因 突变 N-乙基-N-亚硝基脲 环磷酰胺 流式 外周血红细胞CD59缺失率 -
体内彗星实验联合微核实验检测化合物的遗传毒性
目的:考察体内彗星实验联合微核实验检测化合物遗传毒性的可行性.方法:以阳性化合物N-乙基-N-亚硝基脲为模型药物,取6大鼠随机分为空白对照组和给药组[40 mg/(kg·d)],每组5只,灌胃给药3次,末次给药后3h处死大鼠.进行彗星实验,收集大鼠外周血、肝、胃、睾丸组织经前处理制备成单细胞凝胶玻片进行电泳,使用Komet 6.0软件分析单细胞显微图像,每种组织分析100个细胞(胃组织50个细胞),计算尾部DNA百分含量.进行微核实验,收集大鼠骨髓细胞进行涂片,计数2 000个嗜多染红细胞(PCE)中含微核细胞(MNPCE)的数目及嗜多染红细胞微核率.结果:与空白对照组比较,模型药物可使大鼠外周血淋巴、肝、胃、睾丸细胞组织的尾部DNA百分含量明显增加(P＜0.05),并可使大鼠骨髓嗜多染红细胞微核率明显升高(P＜0.05).结论:彗星实验可用于动物体内多种脏器遗传毒性的检测;微核实验可用于动物骨髓细胞的遗传毒性检测.
关键词： 彗星实验 微核实验 遗传毒性 大鼠 N-乙基-N-亚硝基脲 -
大鼠体内Pig-a基因突变试验的优化及ENU时-效关系和量-效关系评估
目的 对大鼠Pig-a基因突变试验方法进行优化,并初步探讨阳性诱变剂N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)在该实验中的时-效关系和量-效关系.方法 30只雄性SD大鼠随机平均分为5组,即溶剂对照组,ENU10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg和80 mg/kg 4个剂量组,连续3d经口灌胃染毒.分别于实验第0、15、30、45、60、75、90天尾静脉取血,分离红细胞,经Anti-CD59-APC和SYTO 13核酸染料标记后采用流式细胞仪分析CD59表型突变为成熟红细胞(RBCCD59-)率、CD59表型突变为网织红细胞(RETCD59-)率以及RET占总红细胞百分率.结果 ENU各组大鼠在染毒后第15～90天的RBCCD59-率呈现随时间和剂量反应性地增高.RETCD59-率随时间延长,ENU各组表现为先增后基本稳定伴小幅波动趋势,但均保持在较高水平,在染毒后30 d出现高峰,在45 d时出现下降;同时,随着ENU剂量的增加,ENU各组RETCD59-率也随之增加.随时间延长,ENU各组大鼠RET百分率有所下降,30 d后呈现较为稳定的轻微波动,5组间RET％在各时间点处差异均无统计学意义.结论 本研究改良的大鼠Pig-a基因突变试验可进行快速检测,ENU短期(3 d)染毒诱导大鼠红细胞Pig-a基因突变具有时-效关系和量-效关系.
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SD大鼠连续灌胃给药对碱性彗星电泳和骨髓微核的影响
目的:开展SD大鼠3天重复经口灌胃给药毒性实验,联合肝、肾和外周血碱性彗星电泳试验和骨髓微核试验,并对遗传毒性试验常用的溶媒及阳性化合物进行检测和比较.通过对比相同实验条件下开展的以染色体损伤和DNA断裂为检测终点的组合遗传毒性试验结果,为给药和取材时间点以及阳性剂的选择提供参考依据.方法:雄性SD大鼠随机分为去离子水组、0.9％氯化钠注射液组、玉米油组、环磷酰胺(CPA) 10mg· kg-1组、环磷酰胺(CPA) 40 mg·kg-1组、Ⅳ-乙基-N-亚硝基脲(ENU) 40 mg· kg-1组和甲磺酸乙酯(EMS) 200mg·kg-1组,每组5只.连续3d灌胃给药,实验期间记录动物临床症状和体重变化.末次给药后3h处死大鼠.称量肝、肾脏器重量,并收集肝、肾及外周血制备单细胞悬液开展多脏器碱性彗星试验.样本制片后分别经裂解、解旋、电泳、染色等步骤,使用Komet 6.0软件进行图像分析;取材同时收集骨髓细胞制作涂片,计数2 000个嗜多染红细胞(PCE)的含微核细胞发生率.结果:1)CPA、ENU和EMS均未对动物整体产生严重的毒性作用.2)只有EMS组的肝细胞、肾细胞和淋巴细胞的刺猬细胞百分率明显升高,CPA及ENU对刺猬细胞百分率无明显影响.ENU组在3种组织的彗尾DNA含量百分率及Ohve尾矩与溶媒对照组比较为弱致DNA断裂作用;而EMS则在3种组织中均显示了强致DNA断裂作用.3)CPA作为经典的骨髓微核试验阳性剂,其微核结果显示了一定的剂量相关性;ENU的致微核作用相对较弱.结论:将多脏器彗星试验与微核试验与3天重复给药毒性实验整合是可行的;实验流程的标准化、阳性剂的选择及实验设计等需根据具体情况来设计.
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体内Pig-a基因突变试验高通量方法联合验证研究
目的:建立大鼠磷脂酰肌醇聚糖A类(Pig-a)基因突变试验高通量方法,验证该方法的重复性,并探索将此方法与流式体内微核整合至同一个试验中的可能性.方法:将20只雄性SD大鼠按照体质量随机分为4组:溶剂对照组(PBS,pH=6.0)、N-乙基-N-亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)低剂量组(10 mg/kg)、ENU中剂量组(20 mg/kg)和ENU高剂量组(40 mg/kg),给药容量均为10mL/kg,经口灌胃给药,每天1次,连续给药3d.分别于给药前1天、首次给药后第14和30天颈静脉取血,进行Pig-a基因突变分析;首次给药后第4天颈静脉取血,采用流式细胞仪进行微核检测.结果:在首次给药后第14和30天,3种剂量(10、20和40mg/kg)下的ENU均导致大鼠外周血RBCCD59-和RETCD59-频率显著增加(P＜0.05),Pig-a基因突变结果与之前的基础型试验得到的结果类似,分析速率和分析细胞的数目得到显著提升;3个剂量的ENU均导致明显的微核率升高,与对照组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论:本研究成功建立了大鼠体内Pig-a基因突变高通量试验方法,该试验具有较好的重复性,并提示该试验可以和微核试验结合到同一个试验中.
关键词： N-乙基-N-亚硝基脲 PIG-A基因突变 免疫磁珠筛选 微核 流式细胞术
