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悬滴和悬浮法相结合培养胰腺祖细胞
目的 建立悬滴和悬浮法相结合培养胰腺祖细胞的方法,研究该方法能否诱导胰腺祖细胞在体外分化为成熟的内分泌细胞.方法 体外分离小鼠12.5d胚胎胰腺,消化成单个细胞,悬滴法培养24h后细胞形成球体,将细胞球转移到下层为培养基漂浮的膜上培养6d.培养过程中,采用免疫组织化学方法检测胰腺十二指肠同源盒基因1(PDX-1)和神经源素3 (Ngn3)的表达及胰岛素、胰高血糖素、羧肽酶(CPA)的表达,酶联免疫吸附法检测葡萄糖刺激后细胞球分泌胰岛素的变化,定量PCR检测培养过程中胰腺标志表达的变化.结果 细胞球培养1d后,有大量PDX-1表达,而且这些PDX-1阳性细胞增殖.细胞球培养3d后,Ngn3大量表达,Ngn3阳性细胞不增殖.培养7d后,分化的胰腺细胞表达成熟内、外分泌细胞的标志,而且胰腺标志的表达与体内表达模式一致.高糖能刺激细胞球分泌胰岛素.结论 悬滴和悬浮法相结合能诱导胰腺祖细胞在体外分化为成熟的内分泌细胞.
关键词： 胰岛素 腺十二指肠同源盒基因1 神经源素3 胰腺祖细胞 -
一种高效诱导胚胎胰腺细胞分化为内分泌细胞培养方法的建立
目的 建立一种使胚胎胰腺细胞体外高效分化为成熟内分泌细胞的培养方法.方法 体外分离小鼠12.5d的胚胎胰腺,培养于下层为培养基的漂浮膜上7d,采用免疫组织化学方法检测胰腺祖细胞标志胰腺十二指肠同源盒基因1 (PIDX-1)和神经源素3(Ngn3)的表达及内、外分泌细胞的标志胰岛素、胰高血糖素、羧肽酶表达,定量PCR检测培养过程中胰腺标志表达的变化.结果 胚胎胰腺培养1d后,有大量胰腺祖细胞标志表达,且这些胰腺祖细胞处于增殖状态.培养3d后,仍有胰腺祖细胞的标志大量表达.培养7d后,分化的胰腺表达成熟内、外分泌细胞的标志,且胰腺标志的表达与体内表达模式一致.结论 建立了一种使胚胎胰腺细胞体外高效分化为成熟内分泌细胞的培养方法.
关键词： 胰腺 胰岛素 腺十二指肠同源盒基因1 神经源素3 -
真核过表达载体共转染3个胰岛发育关键基因在小鼠胎肝细胞内的表达
背景:大量文献表明,向肝脏细胞引入一个多个胰岛发育的关键因子(如Pdx1、MafA及Ngn3)可以使肝细胞向胰岛细胞的方向进行转化.目的:构建以pcDNA3.1(+)为骨架的质粒载体并共同转染胰十二指肠同源框蛋白(Pdx1)、神经源素3(Ngn3)及V型肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A(MafA)至小鼠胎肝细胞并检测其表达情况.方法:以基因组或小鼠胰腺cDNA为模板扩增Pdx1、MafA及Ngn3三个目的基因,应用分子生物学技术,将3个目的片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点中,构建小鼠系列真核过表达载体pcDNA3.1(+)-MafA ORF,pcDNA3.1(+)-Pdx-1 ORF,pcDNA3.1(+)-Ngn3 ORF通过Lipofectamine2000介导的脂质体转染小鼠胎肝细胞系BNL CL.2,用反转录PCR以及间接免疫荧光法检测3个目的基因的表达情况.结果与结论:目的基因克隆正确,反转录PCR,间接免疫荧光法证实了脂质体转染后小鼠胎肝细胞中有Pdx1、Ngn3以及MafA的表达.结果表明,真核过表达载体pcDNA3.1(+)-MafA ORF,pcDNA3.1(+)-Pdx-1 ORF,pcDNA3.1(+)-Ngn3 ORF可成功构建,并能够将Pdx1、Ngn3以及MafA三个基因转至小鼠胎肝细胞进行表达.
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Pdx1与Ngn3协同诱导LO2细胞分化为胰腺β样细胞
目的:胰腺十二指肠同源框蛋白1(Pdx1)与神经源素3(Ngn3)联合诱导肝实质细胞向胰腺β样细胞分化.方法:以人胚胎胰腺组织基因组的mRNA为模板经RT-PCR扩增获得Pdx1与Ngn3基因.应用分子生物学技术,分别克隆到真核表达载体pEGFP-C1的多克隆位点中,构建pEGFP-C1/Pdx1与pEGFP-C1/Ngn3真核表达质粒,并共转染LO2细胞,用RT-PCR、免疫组化、间接荧光法检测目的基因及胰岛素相关基因葡萄糖转运体2(GLUT2)与胰岛素的表达情况.结果:目的基因克隆正确,RT-PCR、免疫组化、间接荧光证实转染后LO2细胞中有Pdx1、Ngn3和胰岛素及胰岛素相关基因GLUT2的表达.结论:Pdx1与Ngn3协同作用可诱导肝实质细胞向胰腺β样细胞分化.
关键词： 胰腺十二指肠同源框蛋白1 神经源素3 LO2细胞 转分化 胰腺β样细胞
