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应用单链探针反向杂交试验检测结核分枝杆菌耐药性分析
目的 探讨单链探针反向杂交试验检测结核分枝杆菌耐药性,评价此方法在耐药性检测中的临床应用价值.方法 采用聚合酶链反应- 单链探针反向杂交试验技术,PCR 扩增50 株结核分枝杆菌rpoB、katG、rpsL、rrs、embB 耐药基因,将标记生物素的基因扩增产物与固定在硝酸纤维膜上的核酸探针杂交,通过链亲和素碱性磷酸酶,BICP/NBT 显色系统检测分析基因突变,同时与传统药物敏感实验比对分析.结果 PCR-LiPA 方法分析50 株结核分枝杆菌临床分离株,耐RFP 菌株中检出4 株,耐INH 菌株中检出5 株,耐SM 菌株中检出7 株,SM 敏感株检出1 株,50 株rrs 基因均未检测到相应位点的突变;耐EMB 菌株1 株、EMB 敏感株1 株检测到embB 基因突变.结论 应用PCR-LiPA 可快速、简便地检出部分结核分枝杆菌耐药株,可作为临床辅助诊断手段.
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PCR-SSCP快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的研究
目的 探讨PCR-SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因作为新的分子药敏试验方法的价值.方法 应用PCR-SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因核心区的突变,同时对片段长度为215bp的PCR扩增产物进行测序分析.受试菌为23株利福平敏感结核分枝杆菌以及35株利福平抗性结核分枝杆菌.结果 23株利福平敏感结核分枝杆菌分别用PCR-SSCP和PCR扩增片段测序均没有检测到rpoB碱基突变.而在35株利福平抗性菌株中,PCR-SSCP检测到31株与H37Rv标准株不同的带谱,PCR-SSCP检测基因突变的敏感度和特异度分别为88.6%(31/35)和100%(23/23).对35株利福平抗性菌株PCR扩增产物进行测序分析,在其中32株中检出了基因突变.测序分析检测基因突变的敏感度和特异度分别为91.4%(32/35)和100%(23/23).卡方检验,PCR-SSCP和PCR扩增片段测序两种方法的敏感度之间没有显著性差异(P＞0.05).若以DNA测序为标准,则PCR-SSCP检测基因突变的准确度、敏感度和特异度分别为93.1%(54/58),96.9%(31/32)和100%(23/23).结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变可用于利福平药物敏感度的快速测定.
关键词： 聚合酶链反应-单链构象多态性 ropB基因 药物耐受性 结核分枝杆菌
