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Cell SELEX技术筛选巨噬细胞源性泡沫细胞适配子的初步研究
目的 利用Cell SELEX 技术筛选巨噬细胞源性泡沫细胞适配子.方法 通过80 mg/L 氧化性低密度脂蛋白诱导THP-1 巨噬细胞为泡沫细胞;聚合酶链反应扩增文库;生物素- 链霉亲和素磁珠分离法构建单链DNA 文库;以巨噬细胞源性泡沫细胞为靶细胞,巨噬细胞和血管平滑肌细胞为反筛细胞,利用Cell SELEX 技术筛选与巨噬细胞源性泡沫细胞结合的寡核苷酸序列,并对后一轮筛选结果进行克隆测序.结果 PCR 的退火温度对PCR 产物的量有显著的影响,退火温度由65℃提高为72℃时的产物量明显增加.利用生物素- 链霉亲和素磁珠分离法获得了纯度高、产量大的ssDNA文库;经过18 轮筛选后,成功获得了28 个与预期大小相同的ssDNA 序列.结论 利用Cell SELEX 技术筛选出了巨噬细胞源性泡沫细胞的适配子,为研发用于动脉粥样硬化的早期无创诊断试剂和靶向治疗药物奠定了基础.
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乳液单引物PCR构建随机ssDNA文库方法的建立及优化
目的 建立并优化乳液单引物PCR扩增法,高效构建高质量随机ssDNA文库,以提高从随机文库中筛选适配子的几率.方法 构建长90 bp(含52 bp随机序列)寡核苷酸文库,用乳液PCR转换成dsDNA文库,再以dsDNA文库为模板,分别用乳液单引物PCR和常规单引物PCR扩增制备ssDNA文库,并对二者进行比较.通过改变模板、聚合酶、dNTP和引物浓度优化乳液单引物PCR反应条件.结果 乳液PCR能高效扩增出dsDNA文库且无副产物;常规单引物PCR构建ssDNA文库时,15个循环时即有大量副产物产生,且与产物条带混合一起无法分离;而乳液单引物PCR从15 ～35个循环均无副产物生成,且产物量多于常规单引物PCR.在优化乳液单引物PCR时,模板浓度对产物量影响大,引物浓度对副产物的量影响大.结论 乳液单引物PCR能显著提高产物量并控制副产物的量,可提高指数富集配体进化(SELEX)技术筛选效率.
关键词： 乳液PCR 乳液单引物PCR 适配子 指数富集配体进化技术 随机ssDNA文库 -
筛选环孢霉素A适体的SELEX技术的建立
目的:运用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术,筛选并鉴定环孢霉素A(CsA)特异性的适体.方法:合成一个全长78个核苷酸中间含35个随机序列的随机单链寡核苷酸序列(ssDNA)文库,通过SELEX方法,即以磁珠作为筛选介质,利用生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶系统检测每轮ssDNA文库与CsA的亲和力,筛选针对CsA的适体,将后一轮筛选产物克隆测序并运用相关软件进行一级结构和二级结构分析.结果:经过10轮的筛选,ssDNA文库与CsA的亲和力呈上升趋势,随机挑选的19个克隆适体根据一级结构的同源性可分为5个家族,二级结构预测以茎环(发夹)为主.结论:我们通过改良SELEX方法筛选得到了CsA特异性的适体.
