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SELEX技术及其应用研究进展
SELEX技术是一类在体外筛选能与各种配体特异结合的寡聚核苷酸片段的一项新组合化学技术,具有靶分子范围广,筛选出的配体亲和力和特异性高等特点.筛选出的特异寡聚核苷酸片段,不仅在疾病的诊断、治疗与药物的快速开发等方面起着重要作用,也为核酸结构和功能的研究提供了一个有效的方法.
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SELEX技术在毒理学研究中的应用
适体(aptamer)指用指数富集的配体系统进化(SELEx)技术筛选获得的能与多种靶标特异高效结合的单链或双链寡核苷酸,具有靶标范围广、亲合力高、特异性强、稳定性好、制备方便等诸多优点.SELEX技术自20世纪90年代问世后倍受重视,发展迅速,目前已广泛应用于生命科学领域,特别是在研究分子结构的基础领域、毒物分析化验、临床药物研制等方面发展突飞猛进.
关键词： 指数富集的配体系统进化(SELEX) 适体 毒理学 -
筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的研究
目的 建立SELEX技术筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的方法,并获得CFP-10 的高亲和性适体.方法 体外构建长度为78个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库,以微孔板为筛选介质,采用SELEX 技术筛选获得CFP-10的适体库.将适体库克隆、测序,用DNAMAN软件对其结构进行分析,利用酶联寡核苷酸吸附试验(enzyme-linked oligonucleotide sorbent assay,ELOSA)测定亲和力.结果 构建的ssDNA文库经过14轮筛选与CFP-10亲和力从0.273提高到1.265;克隆子测序,大多数长度与预期值相符.二级结构显示,口袋和茎环结构可能是适体与CFP-10结合的结构基础.结论 成功建立了SELEX筛选技术,并初步获得了CFP-10的高亲和性适体.
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MPT64抗体的适体在结核病血清学检测中的应用
目的 利用SELEX技术筛选MPT64抗体的适体建立混合夹心ELISA检测体系,应用于临床血清标本的检测,探讨该方法 潜在的实验室诊断价值.方法 利用竞争ELISA检测方法 ,测定不同浓度的MPT64抗原对后一轮ssDNA文库与靶物质亲和力的抑制率,选取优势序列且亲和性值较高的适体用于检测,优化混合夹心ELISA检测方法 ,确定MPT64抗体的检测下限和线性范围,同时检测230例临床血清标本.结果 在竞争ELISA结果 中,总反应体系为100μl,MPT64抗原浓度由2μg/ml增加到256 μg/ml时,对ssDNA文库的抑制率也由0.25%增加到80%.优化的混合夹心ELISA的检测体系:ssDNA包被浓度为0.1μg/孔、血清稀释度为1/200、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体浓度为1/40 000.MPT64抗体的检测下限为3 mg/L,线性范围为10～1000 mg/L.利用该体系检测100例结核病患者、100例健康体检者和30例非结核病患者血清,检测结果 用GraphpadPrism软件进行分析,结核病组与健康体检组、结核病组与非结核疾病对照组差异均具有统计学意义(P<0.001).统计学分析得到检测的特异性与敏感性分别为96.1%和31.0%.结论 利用适体建立的混合夹心ELISA用于结核病的血清学诊断具有一定的诊断价值.
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结核分枝杆菌ESAT-6抗原适体的筛选与亲和性分析
目的 通过建立指数级富集配体的系统进化技术(SELEX),筛选结核分枝杆菌ESAT-6抗原适体的方法,获得ESAT-6的高亲和性适体,为结核病诊断和治疗试剂的开发奠定基础.方法 体外构建一个长度为78个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库,以微孔板为筛选介质,SELEX技术筛选获得ESAT-6的适体库,将适体库克隆、测序,用DNAMAN软件对其结构进行分析,利用生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定亲和力,找出高亲和性适体.结果 经过13轮筛选,ssDNA文库与ESAT-6亲和力从0.257提高到1.163,且12轮后A值趋于平衡,克隆、测序获得ESAT-6的高亲和性适体,其中适体A10亲和力高,达到1.515,且与CFP10-ESAT6融合蛋白无交叉反应.二级结构显示,口袋和茎环结构可能是适体与ESAT-6结合的结构基础.结论 成功建立了SELEX筛选技术,并初步获得了ESAT-6的高亲和性适体.
关键词： 分枝杆菌 结核 ESAT-6 指数级富集配体的系统进化技术 适体 -
适配子技术在自身免疫性疾病研究中的应用
适配子是能通过特定三维结构与多种靶标紧密结合的寡核苷酸或肽.由于具有亲和力高,特异性好,分子量小,免疫原性低,结构稳定,易合成等优点,适配子替代传统抗体,在多种疾病的基础研究、药物筛选、临床诊断及疾病治疗中具有广泛的应用前景.现对适配子技术在自身免疫性疾病的诊断、治疗和致病机制研究中的应用现状及进展进行阐述.
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结核分枝杆菌MPT64蛋白适配子的筛选与鉴定
目的 利用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选能与结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64特异性结合的寡核苷酸适配子,寻找早期诊断结核病的方法.方法 体外合成随机单链DNA(ssDNA)文库,以MPT64蛋白为靶物质,采取SELEX技术进行12轮筛选,将适配子库克隆、测序后,用DNAMAN软件对其结构进行分析,经生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定亲和力,并利用捕获适配子与检测适配子组成的"三明治"夹心法对获得的适配子进行初步验证.将13个非结核分枝杆菌菌株和BCG菌株作为阴性组计为0,将结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌组作为阳性组计为1,采用MedCalc软件分析受试者操作特征曲线,确定佳阳性判定值,并构建散点图.结果 经12轮筛选后,随机挑选15个适配子与MPT64蛋白的亲和性进行分析,吸光度值为0.492～1.243,73.3％的适配子的吸光度值在1.0以上;二级结构分析显示,适配子与MPT64蛋白亲和性的基础主要是大口袋茎环结构,口袋与环之间的茎桥含有不同数量的GC碱基对;"三明治"夹心法对阴性组[非结核分枝杆菌标准菌株及卡介苗(BCG)株]和阳性组(结核分枝杆菌实验室H37Rv株及临床株、牛结核分枝杆菌标准株)共47个菌株培养上清的检测结果显示,在临界(cut-off)值为0.61时,H37Rv、牛结核分枝杆菌组为阳性,BCG株为阴性;阴性组标本的阴性检出率为85.7％,阳性组标本的阳性检出率为87.9％,表现出一定的检测价值.结论 已初步筛选到与MPT64蛋白具有高亲和性的DNA适配子.
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抗病毒适体药物的研究进展
核酸适体具有靶分子范围广、亲和力高、特异性强等优点,被广泛应用于检测诊断和药物研发等领域.在抗病毒作用方面,适体独特的空间结构和膜穿透能力,不但可分别与病毒的胞膜、基因组、酶等病毒成分结合而抑制病毒感染,还可通过互相连接或与siRNA连接来共同实现抗病毒作用.本文主要以艾滋病病毒和丙型肝炎病毒为例,阐述适体在各个阶段阻止病毒入侵的作用机制及研究进展,为开发新型抗病毒药物提供思路.
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适体介导的药物靶向递释系统的研究进展
目的 综述适体(aptamers)在介导药物靶向递送方面的研究进展.方法 查阅近年来国内外相关文献,对适体的产生及特点进行阐述,并整理、分析和归纳其在药物靶向递送系统中的应用.结果与结论 适体是一类能与许多生物大分子或细胞特异性结合的核酸分子,能够介导药物或载体到达特定的器官、组织甚至细胞,从而提高药物在靶组织/靶细胞的浓度,为药物靶向递送系统的研究提供了新的思路和方向.
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以大肠埃希菌tolC蛋白为靶标的适配体的筛选及结构分析
目的:筛选大肠埃希菌外排泵tolC蛋白的核酸适配体.方法:重组表达大肠埃希菌外排泵外膜蛋白tolC,利用指数富集的配体系统进化技术(stematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)从单链DNA文库中筛选出一组能够特异性与其结合的核酸适配体.利用FITC荧光素标记技术检测每轮单链DNA文库与靶蛋白的亲和力,直至亲和力的上升趋于饱和,将后一轮筛选产物克隆测序,并用DNAman软件分析其二级结构.结果:经过12轮筛选,单链DNA文库与靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第12轮筛选产物克隆测序,对获得的23个适配体进行分析.一级结构分析显示23个适配体并无共同的保守序列,但分别有3对和2对适配体序列完全一致.二级结构预测分析表明,茎环结构为适配体主要的结构形式,提示其可能是适配体与tolC蛋白蛋白特异性结合的基础.根据二级结构特点可将23个适配体分为4个家族,其中20号适配体与靶标蛋白亲和力高.结论:成功利用SELEX技术筛选获得了特异结合tolC的高亲和力的核酸适配体,为大肠埃希菌耐药干预及机制研究奠定了基础.
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人重组S100A8蛋白适配体的筛选和结构分析
目的:筛选人重组S100A8蛋白特异性的适配体.方法:采用配体指数级富集系统进化(systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技术,以人重组S100A8蛋白为靶蛋白,以微孔板为筛选介质,从体外合成的随机单链DNA文库中筛选其适配体.利用生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统检测每轮单链DNA文库与靶蛋白的亲和力直至亲和力的上升趋于饱和,将后一轮筛选产物克隆测序,并进行生物信息学分析.结果:经过11轮筛选,单链DNA文库与人重组S100A8蛋白的亲和力趋向稳定,将第11轮筛选产物克隆测序,对获得的30个适配体进行分析.一级结构分析显示30个适配体并无共同的保守序列,但有3对适配体序列完全一致.二级结构预测分析表明,茎环和口袋结构为主要的结构形式,提示其可能是适配体与人重组S100A8蛋白特异性结合的基础.根据茎环和口袋的相对比例可将30个适配体分为4组,其中第1组中35号适配体与人重组S100A8蛋白亲和力高.结论:获得了与人重组S100A8蛋白特异性结合的适配体群,为后续适配体的应用研究以及S100A8蛋白功能的研究奠定了基础.
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胃癌微转移检测的现状和展望
微转移是恶性肿瘤在发展过程中所形成的尚处于临床不可探测阶段的微小转移灶,播散并存活于淋巴系统、血液循环、骨髓、肝、肺等组织器官中,是恶性肿瘤复发和转移的根源.微转移与胃癌的发展及预后密切相关,胃癌微转移检测可用于指导胃癌的分期诊断和制订个体化治疗方案.现就胃癌微转移检测研究的现状和存在的问题予以综述.
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AS1411对紫杉醇耐药肺腺癌A549细胞凋亡的影响
目的 探讨核酸适配子AS1411对紫杉醇耐药肺腺癌A549细胞(A549/T细胞)凋亡的影响.方法 采用0 ～ 20.0 μmol/L浓度的AS1411处理A549/T细胞,甲基甲苯基硫细胞检测(MTS)实验、平板克隆形成实验检测细胞活性[吸光度值(A490nm)]及增殖能力变化,流式细胞仪检测对细胞凋亡的影响,同时应用蛋白免疫印迹法检测凋亡信号通路相关蛋白表达的变化.结果 A549/T细胞呈现部分上皮细胞间质化(EMT)、表皮生长因子受体(EGFR)表达缺失等特征.经5.0 μmol/L的AS1411处理后,与对照序列相比,A549/T细胞的细胞活性显著降低(A490nm:0.185±0.009比0.272±0.006,P＜0.001)、克隆形成数显著减少(74±13比120±12,P=0.010);随AS1411浓度的增加,细胞活性明显降低,呈剂量依赖性.用20.0 μmol/L的AS1411处理48 h后,A549/T细胞凋亡率显著高于对照序列[(19.9±2.6)％比(8.8±1.3)％,P=0.002],同时蛋白激酶B(AKT)、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)表达均显著低于对照序列处理组(0.353±0.003、0.432±0.015、0.294 ±0.015比0.688±0.003、0.911±0.019、0.422±0.018,均P＜0.001).结论 AS1411可通过抑制AKT-ERK通路而促进A549/T细胞凋亡.
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Aβ阻断肽适配子TRX1-ABAD-DP-TRX2融合基因的克隆及表达
目的 将Aβ阻断肽(ABAD-DP) cDNA插入人硫氧化还原蛋白(hTRX)的活化位点,克隆融合基因TRX1-ABAD-DP-TRX2 (T-A-T) cDNA,为基因治疗阿尔茨海默病奠定基础.方法 通过PCR获得目的片段TRX1、TRX2、ABAD-DP,进一步将上述3目的片段按既定顺序插入腺相关病毒穿梭质粒pSSHG-CMV的多克隆位点,从而获得融合基因TRX1 -ABAD-DP-TRX2.经PEI介导Hela细胞包装重组腺相关病毒rAAV/T-A-T.感染NIH-3T3细胞,通过荧光免疫组织化学染色检测融合基因的表达及其与Aβ42的定位.结果 酶切后得到TRX1 -ABAD-DP-TRX2融合基因片段的大小约为435 bp,与理论值一致.荧光免疫组织化学染色检测到融合基因的表达,且共定位组T-A-T和Aβ42均位于NIH-3T3细胞胞质内.结论 成功克隆及表达了Aβ阻断肽适配子TRX1-ABAD-DP-TRX2融合基因,为进一步将阻断肽用于基因治疗阿尔茨海默病提供了基础.
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适配子修饰的靶向超声/光声双模态造影剂的体外寻靶及显像研究
目的 研究适配子修饰的包裹纳米金棒和液态氟碳的靶向PLGA纳米粒体外寻靶能力,观察其介导超声/光声显像的现象.方法 采用双乳化法制备PLGA纳米粒,用碳二亚胺法将MUC1适配子与PLGA纳米粒连接得到“适配子-PLGA纳米粒”靶向相变造影剂.以荧光显微镜检测其与其特异性识别的乳腺癌MCF-7细胞的体外靶向情况,并设置普通纳米粒组、适配子干扰组及HELA细胞组三个对照组.用光声仪来观察其介导的体外超声/光声信号增强的现象.结果 靶向纳米粒在MCF-7细胞周围大量聚集并牢固结合,而非靶向纳米粒组、适配子干扰组及HELA细胞组均未见明显特异性结合.靶向纳米粒在光声仪激发后,超声信号与光声信号较激发前有明显增强.结论 成功制备的靶向纳米粒对乳腺癌MCF-7细胞有良好的靶向性及特异性,其对超声/光声显像效果明显,具备成为超声/光声双模态靶向造影剂的各项特性,为后续的体内寻靶实验提供实验基础,有望成为良好的靶向诊断分子探针.
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特异性结合白色念珠菌（1，3）-β-D-葡聚糖单链 DNA 适配子的筛选及其应用
目的：通过指数富集的配基系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment ，SELEX）筛选能与高亲和力（1，3）‐β‐D‐葡聚糖特异性结合的适配子，并用该适配子建立双适配子夹心酶联寡聚核苷酸吸附试验（enzyme‐linked oligonucleotide assay ，ELONA）来对深部真菌感染血浆进行辅助诊断。方法提取白色念珠菌 ATCC10231株细胞壁（1，3）‐β‐D‐葡聚糖，通过 SELEX 筛选获得能与（1，3）‐β‐D‐葡聚糖特异性结合的高亲和力单链 DNA 适配子，并用该适配子建立双适配子夹心ELONA 来检测深部真菌感染血浆中的（1，3）‐β‐D‐葡聚糖。结果从白色念珠菌细胞壁中成功提取了高聚合度（1，3）‐β‐D‐葡聚糖，并通过体外酶解获得可溶性低聚合度（1，3）‐β‐D‐葡聚糖作为筛选靶标。用SELEX 进行12轮筛选后，从初始单链 DNA 文库中获得2个高亲和力适配子 AU1和 AD1，检测发现它们并非结合于（1，3）‐β‐D‐葡聚糖的同一表位。双适配子夹心 ELONA 检测深部真菌感染血浆中（1，3）‐β‐D‐葡聚糖的特异性和敏感度分别为91．94％和92．31％。结论从初始单链 DNA 文库中成功获得可与（1，3）‐β‐D‐葡聚糖特异结合的高亲和力适配子，为深部真菌感染新型诊断试剂的研发奠定了基础。
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B淋巴细胞活化因子特异的单链DNA适体的人工进化
目的:进化筛选与B淋巴细胞活化因子(B cell activating factor belonging to the TNF family,BAFF)特异结合的单链DNA适体,鉴定其结合力.方法:应用指数方式富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术,将随机序列寡核苷酸文库与BAFF分子相互作用,分离出结合的寡核苷酸配体,经反复扩增、筛选数个循环,获得重组人BAFF的单链DNA适体,应用Dot blotting鉴定其结合力,酶联法比较各适体序列对BAFF的相对结合力.结果:优化实验条件后成功进行了13轮次筛选,随机选取42个阳性克隆测序,各序列GC含量高达75%,分为6类不同序列;Dot blotting证实这些适体均与BAFF相结合;比较各适体序列结合BAFF的光密度值,以序列44光密度值高(0.752,P《0.05),具有对BAFF相对高结合力.结论:首次成功获得特异结合BAFF的高亲和力的单链DNA适体,为研发防治肿瘤和自身免疫疾病新药奠定了基础.
关键词： B淋巴细胞活化因子 适体 单链DNA 指数富集的配体进化技术 进化 -
配体指数级系统进化技术与医学检测
配体指数级系统进化技术(SELEX,systematic evolution of ligands by exponential enrichment),是近年发展起来的研究核酸结构、功能及进化的一种新的组合化学技术.它是应用大容量的随机寡核苷酸库,结合PCR扩增,指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸,经过几轮或数十轮筛选过程,获得高亲和力、高特异性的寡核苷酸配基,即适体(aptamer).
关键词： 适体 配体指数级系统进化技术 实验诊断 -
用SELEX技术筛选葡萄球菌肠毒素B特异性适配体
目的 通过指数级富集配体的系统进化技术(SELEX)筛选能与葡萄球菌肠毒素B(SEB)特异、高素和力结合的单链DNA(ssDNA)适配体(aptamer).方法 体外构建一个长度为96个碱基的随机ssDNA文库,与靶物质SEB混合,以磁殊作为固相介质,利用热洗脱方法分离与靶标结合的核苷酸片段,通过PCR反复扩增、富集数个循环.利用荧光素标记适配体,测定筛选过程中各轮结合率;通过地高辛标记适配体,与碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体进行酶促显色反应,检测适配体的特异性.结果 经过13轮筛选,ssDNA文库与SEB的结合百分率从1.1%提高到39.8%.制备的适配体针对SEB的特异性强,与葡萄球菌A蛋白(SPA)及牛血清清蛋白(BSA)无非特异性结合.结论 成功利用SELEX技术筛选获得了特异结合SEB的高亲和力的ssDNA适配体,为金黄色葡萄球菌感染的诊断与治疗奠定了基础.
关键词： 指数富集的配体进化技术 SEB 适体 磁珠 -
精斑鉴别技术进展
斑痕类型鉴别是法医物证检验的重要步骤之一,精斑中所含有的DNA和RNA的鉴定可以提供识别犯罪嫌疑人的个性证据,因此精斑的确认对案件属性和犯罪事实具有至关重要的作用.精斑识别的传统方法注重检测其中特异性的功能蛋白或者含量高的蛋白,如碱性磷酸酶、前列腺特异性抗原等.尽管这些标志物特异性相对较强,但蛋白质稳定性差,灵敏度低,检测结果易带主观性倾向等,限制了传统方法的检出率.为了克服这些限制,拉曼光谱法、质谱检测蛋白标志物、精子适体技术、特异性mRNA和microRNA的检测、组织差异DNA甲基化等新技术相继出现,这些方法为微量、甚至陈旧性等疑难检材的个性鉴定开辟了新的途径.
