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噪声损伤引起耳蜗外毛细胞凋亡时细胞核内单链DNA的产生及EndoG的转移
目的 观察噪声损伤后耳蜗外毛细胞内单链DNA和EndoG的变化,探讨耳蜗外毛细胞的死亡机制.方法 豚鼠随机分为噪声暴露组、MNNG耳蜗灌流组和对照组(每组各12只);小鼠随机分为噪声暴露组和对照组(每组12只).分离解剖耳蜗后,用碘化丙啶(PI)染色细胞核、Pholloidin染色F-actin,免疫荧光抗体分别染色单链DNA(ssDNA)、核酸内切酶G(Endonuclease G EndoG)和凋亡诱导因子(Apoptosis inducing factors,AIF),制备耳蜗铺片,激光共聚焦显微镜下观察凋亡和坏死毛细胞内的荧光信号变化.结果 (1)暴露于120 dBSPL的白噪声环境中每天4小时,连续2天后引起豚鼠和小鼠耳蜗外毛细胞凋亡时,其细胞核内产生ssDNA,而在正常细胞内没有三ssDNA;(2)在正常情况下,EndoG分布于耳蜗毛细胞的细胞核外,在暴露于上述噪声后发生凋亡和坏死的豚鼠耳蜗外毛细胞中.EndoG从细胞核外转移到细胞核内,细胞核中的EndoG显著增加;(3)豚鼠耳蜗外淋巴灌流烷化剂MNNG后发生耳蜗外毛细胞凋亡和坏死,在凋亡和坏死的耳蜗外毛细胞中,AIF自线粒体转移到细胞核,其变化与噪声损伤引起耳蜗外毛细胞凋亡和坏死时一致.结论 噪声刺激或烷化剂MNNG灌流后,造成耳蜗外毛细胞DNA损伤,产生ssDNA,引起AIF和EndoG自线粒体释放,激活Caspase-3,AIF和EndoG进一步向细胞核转移,终使细胞核内的DNA降解,导致耳蜗毛细胞的死亡.
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引物长度不对称PCR技术制备单链DNA探针
目的建立引物长度不对称PCR制备单链DNA探针技术,评价单链探针进行斑点杂交的优越性.方法设计1对引物,其中1条引物长度为34bp,复性温度为75.2℃,另1条为20bp,复性温度为55.7℃.首先以52℃的复性温度进行双向对数扩增,获得一定数量的双链DNA,再以72℃的复性温度进行单向扩增,获得单链DNA片段.以含HBV S基因片段的质粒为模板,在PCR体系中加入地高辛标记核苷酸直接制备探针,并收集40份乙型肝炎患者的血清进行斑点杂交检测.结果采用引物长度不对称PCR可成功地制备出单链探针且重复性好.对40份乙型肝炎患者血清进行斑点杂交检测,HBV DNA检出率为40%.双链探针和单链探针的检出率一样,但单链探针的斑点更清晰,背景更好.结论引物长度不对称PCR可能成为制备单链DNA片段或探针的简便而有效方法.单链探针具有高效和简便特点,有广阔的应用前景.
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110 抗单链DNA单克隆抗体在细胞凋亡检测中的应用研究
随着对细胞凋亡研究的深入，发现凋亡与机体的健康和疾病状态息息相关。因而建立一种简便有效的检测凋亡细胞的生物学方法对于临床与基础研究非常重要。近研究发现抗单链DNA的特异性单克隆抗体在检测细胞凋亡方面具有其它方法无可比拟的优势，如高度的特异性与敏感性，低廉的费用，故而有着广阔的应用前景。
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DNA适体筛选中双链DNA拆分方法研究
目的 研究能够用于DNA适体筛选的双链DNA拆分方法.方法 采用琼脂糖凝胶电泳,观察和比较λ核酸外切酶法、不对称PCR法、磁珠法以及琼脂糖凝胶法的拆分效果.结果 琼脂糖凝胶电泳显示,λ核酸外切酶法不能充分拆分双链DNA形成单链DNA；不对称PCR法产生的非特异性单链DNA较多；磁珠法拆分双链DNA获得单链DNA的量较低,且成本较高；琼脂糖凝胶法拆分双链DNA较为充分,单链DNA纯度较高.结论 琼脂糖凝胶法可用于DNA适体筛选中双链DNA的拆分.
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抗ssDNA单克隆抗体的研制和在检测凋亡细胞中的应用
为了制备抗单链DNA单克隆抗体和建立检测细胞凋亡的新方法,采用杂交瘤细胞融合技术用于筛选分泌抗单链DNA抗体的单克隆杂交瘤细胞株,并用斑点印迹和竞争ELISA法鉴定单抗的特异性,进而结合免疫组织化学和免疫荧光方法用于检测凋亡细胞.通过筛选得到单克隆杂交瘤细胞株B17,其分泌的抗体与单链DNA结合而与双链DNA无交叉反应,用此单抗建立的凋亡细胞检测方法能够检测出凋亡细胞,区分非凋亡细胞和坏死细胞.实验结果表明,成功地获得一株分泌特异性抗单链DNA抗体的单克隆杂交瘤细胞株,以此建立的凋亡细胞检测方法特异性高、敏感性强.
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不对称荧光PCR扩增白念珠菌ITS-2基因单链DNA实验
目的 比较在限制性引物不同稀释比例条件下,不对称荧光聚合酶链反应(PCR)扩增白念珠菌5.8S rDNA与28S rDNA间内转录间区2(ITS-2)基因的单链DNA(ssDNA)的实际效果,探讨其体系优化方法.方法 以常规PCR为对照,将20μmol/L的正向引物(P1)按照一定比例预稀释后,分别与20μmol/L的荧光标记反向引物(P2')组成含不同P1水平的引物对,采用不对称荧光PCR扩增真菌ITS-2,并对PCR产物进行电泳和测序分析,比较各实验组扩增ssDNA的效果.结果 不对称荧光PCR成功扩增出白念珠菌ITS-2基因的ssDNA,随着限制性引物水平的降低,ITS-2基因的双链DNA(dsDNA)条带逐渐变淡,而ssDNA条带逐渐变亮;在限制性引物稀释比例达到1:90~1:100时,dsDNA条带已经模糊不清,而ssDNA条带则达到亮.提示在此扩增体系条件下,ssDNA拷贝数多,为不对称荧光PCR扩增白念珠菌ITS-2基因ssDNA的佳扩增条件.PCR产物测序也表明,dsDNA上方的条带为ITS-2基因的ssDNA.结论 通过优化限制性引物水平,不对称荧光PCR可以高效地扩增白念珠菌ITS-2基因的ssDNA.
关键词： 不对称荧光聚合酶链反应 白念珠菌 ITS-2基因 单链DNA -
B淋巴细胞活化因子特异的单链DNA适体的人工进化
目的:进化筛选与B淋巴细胞活化因子(B cell activating factor belonging to the TNF family,BAFF)特异结合的单链DNA适体,鉴定其结合力.方法:应用指数方式富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术,将随机序列寡核苷酸文库与BAFF分子相互作用,分离出结合的寡核苷酸配体,经反复扩增、筛选数个循环,获得重组人BAFF的单链DNA适体,应用Dot blotting鉴定其结合力,酶联法比较各适体序列对BAFF的相对结合力.结果:优化实验条件后成功进行了13轮次筛选,随机选取42个阳性克隆测序,各序列GC含量高达75%,分为6类不同序列;Dot blotting证实这些适体均与BAFF相结合;比较各适体序列结合BAFF的光密度值,以序列44光密度值高(0.752,P《0.05),具有对BAFF相对高结合力.结论:首次成功获得特异结合BAFF的高亲和力的单链DNA适体,为研发防治肿瘤和自身免疫疾病新药奠定了基础.
关键词： B淋巴细胞活化因子 适体 单链DNA 指数富集的配体进化技术 进化 -
系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞单链DNA表达研究
目的 研究系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMC)中单链DNA(ssDNA)表达情况.方法 流式细胞术检测26例SLE患者(SLE组)外周血ssDNA表达阳性的PBMC细胞百分比(ssDNA阳性率),设立正常对照组(n=17)和其他结缔组织病(CTD)对照组(n=7).结果 SLE组、正常对照组和CTD对照组外周血B淋巴细胞中ssDNA阳性率分别为(0.906±0.838)%、(0.216±0.371)%和(0.270±0.311)%.统计学分析表明,SLE组患者外周血B淋巴细胞中ssDNA阳性率显著高于两对照组(P<0.01, P<0.05);SLE组内有与无狼疮肾炎患者的外周血B淋巴细胞中ssDNA阳性率分别为(1.228±0.259)%和(0.510±0.436)%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 SLE和狼疮肾炎的发生和发展可能与患者外周血表达ssDNA的B淋巴细胞异常增多有关.
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指数富集配基系统进化技术筛选三阴乳腺癌适配子中聚合酶链反应扩增条件的优化及单链DNA的制备
目的 优化三阴乳腺癌(TNBC)适配子筛选中单链DNA(ssDNA)文库扩增条件,探讨次级ssDNA佳制备方法.方法 构建ssDNA文库,设置不同的模板量(1012、1011、1010、109、108、107、106、105条带)、循环数(9、12、15、18、21、24、27、30)、DNA聚合酶量(0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 U/μl)进行聚合酶链反应(PCR)扩增;对比3种制备次级ssDNA的方法,取其中佳方法进行筛选.结果 20μl体系优扩增条件为:ssDNA模板量108个条带、扩增循环数为12、DNA聚合酶量为0.100 U/μl;不对称PCR法所得ssDNA量多.结论 确立了ssDNA文库优扩增条件及次级ssDNA佳制备方法,为进一步筛选TNBC特异性适配子提供实验基础.
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口腔鳞癌ssDNA标记指数的研究
目的 调查口腔鳞状细胞癌(OSCC)内的通过单链DNA(ssDNA)免疫组化鉴定的凋亡细胞丧失,并评价阳性细胞百分比与OSCC患者临床预后之间的关系.方法 采用抗ssDNA抗体检测了24例OSCC诊断用活检标本及手术切除标本,并以标记指数(LI)代表阳性细胞百分比,通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的UTP缺口标记(TUNEL)法标记的凋亡细胞百分比被表示为凋亡指数(AI).结果 经化疗药物治疗后,ssDNA LI显著低于治疗前(P＜0.05),而且ssDNA LI的减少与良好预后有关,差异有显著性(P＜0.05).ssDNA LI与AI之间不具有显著性关系.结论 ssDNA LI也许可以充当OSCC惠者的一个预后因子.
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DNA电化学生物传感器测定水中痕量铅
采用物理涂附法将单链DNA固定到金表面得到ssDNA/Au修饰电极.研究表明,该电极在pH 5,0.2 mol/L NaAc-HAc缓冲底液中,可用于测定水中痕量Pb2+.Pb2+以Pb-DNA络合物的形式吸附在电极上,以示差脉冲伏安法测定Pb2+,在0.15 V(vs SCE)处有灵敏的氧化峰,其峰电流与Pb2+浓度在5.0×10-8～1.0×10-6 mol/L范围内呈良好的线性关系,此法的检测限为2.0×10-8 mol/L,该修饰电极的稳定性和抗干扰性都较好.用该电极对饮用水中的Pb进行检测,得到了满意的结果.
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抗单链DNA单克隆抗体的制备及应用
目的:制备特异性的抗单链DNA单克隆抗体,为建立一种特异、敏感、简便的细胞凋亡检测方法奠定基础.方法:根据烷化剂盐酸氮芥能特异性地修饰小牛胸腺DNA链上的鸟嘌呤(G)而暴露互补链上的胞嘧啶(C)这一特性,将修饰后的小牛胸腺DNA连于甲基化的牛血清白蛋白上制备成完全抗原,免疫BALB/c小鼠获得特异性的抗单链DNA单克隆抗体,并对单抗的类别和特异性进行鉴定;用叠氮钠和抗肿瘤药物VP-16诱导了HL60细胞的坏死和凋亡,利用所制备的抗单链DNA单克隆抗体对其进行检测,并与形态学方法、凝胶电泳法和TUNEL法进行了比较.结果:所制备的抗单链DNA单克隆抗体能与羊抗小鼠IgM发生特异性反应,且能与凋亡细胞特异性结合,而不结合坏死细胞.结论:所制备的单抗为IgM型,利用其能特异地结合单链DNA的特性,可用于检测细胞凋亡,简便、有效地区别细胞凋亡和坏死.
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电荷对ssDNA与红细胞结合的影响
目的 改变红细胞电荷性质,克服因红细胞与单链DNA均带负电荷而引起的排斥力,达到单链DNA易与红细胞靠近并特异结合的目的.方法 以不改变红细胞电荷性质的生理盐水及低离子强度液反应介质为对照组,使用凝聚胺溶液反应介质为试验组,在室温下与ssDNA孵育30 min,并定量检测各组结合于红细胞的单链DNA拷贝数.结果 在生理盐水、LISS液、凝聚胺溶液反应介质中,与红细胞结合的单链DNA拷贝数分别为(4.22±2.17)×107/μL、(6.13±5.50)×107/μL、(8.54±2.97)×1010/μL(n=9).试验组与对照组间比较P＜0.05.结论 在凝聚胺溶液反应介质中,携带负电荷的ssDNA可更好地与红细胞结合.与对照组相比,试验组中结合于红细胞的单链DNA拷贝数量级数可提高103拷贝/μL.
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RhD抗体ssDNA适配体的筛选与鉴定
目的 获得具有拮抗RhD抗体能力的特异性核酸适配体.方法 利用SELEX技术,从体外合成的82nt随机单链DNA文库中,筛选出与RhD抗体特异结合的核酸适配体.采用荧光标记法检测核酸适配体与RhD抗体结合的亲和力及特异性,并对中和RhD抗体的剂量效应关系进行分析.结果 通过筛选得到的4个核酸适配体解离常数达到nmol/L水平,其中3号核酸适配体特异性强,其次为1号,而2号与4号无特异性.1号与3号核酸适配体联合使用,浓度分别为50 pmol/L时,可完全中和RhD抗体.结论 利用随机单链寡核苷酸文库成功获得与RhD抗体特异性结合的核酸适配体,所获得的核酸适配体具有拮抗RhD抗体的能力.
关键词： 单链DNA 核酸适配体 RhD抗体 指数富集的配体系统进化技术 -
基于RhD蛋白Aptamer筛选技术的随机ssDNA次级文库制备条件的优化
目的 优化筛选RhD蛋白DNA-aptamer的ssDNA次级文库制备条件.方法 对影响dsDNA扩增的主要参数(退火温度、循环数、模板用量、引物用量等)进行优化,在确定dsDNA扩增条件已优化的基础上,进而优化上、下游引物用量比例及扩增循环数,确定不对称PCR制备ssDNA的佳条件.结果 不对称PCR扩增的佳条件为:上游引物终浓度为1 pmol/μL,上、下游引物浓度比例为20∶1,退火温度为59℃,循环数为30-35.结论 制备条件优化后,经过不对称PCR扩增可获得浓度高、纯度好的ssDNA次级文库.
关键词： RhD蛋白 Aptamer筛选技术 次级文库 核酸适配体 单链DNA -
抗单链DNA单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定
凋亡细胞内由于组蛋白- DNA的稳定性受到破坏或染色质受到修饰, 使得凋亡细胞的DNA对热变性敏感.在适宜条件下, 凋亡细胞的DNA能被热变性为具有足够长度、形成一定构像的单链DNA(single- stranded DNA, ssDNA), 从而被ssDNA特异的单克隆抗体(mAb)染色; 而非凋亡细胞的DNA则不被热变性, 或变性的DNA部分不足以形成与抗ssDNA mAb结合的单链构象决定簇.因此, 用抗ssDNA mAb能敏感、特异地检测到凋亡细胞[1,2].
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抗DNA抗体的免疫学特性
作为自身反应抗体的一个重要组成成分, 抗单链DNA抗体一经发现, 便在免疫学领域引起诸多学者的关注.关于自身抗体的产生, 机体对DNA抗原的免疫应答等研究, 有助于揭开自身免疫病的奥秘.而对抗体-抗原相互作用的研究, 则可填补对核酸抗原了解的匮乏.在这方面的研究中, 发现了许多颇有意义的现象, 如亲和力成熟过程中, 抗原特异性的改变以及其与类别转换的联系等.本文仅对这些研究和发现进行了简要的综述, 以期对抗单链DNA抗体的生物学和免疫学特性有所了解.
