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散发性扩张型心肌病相关HAND1基因新突变
目的 研究散发性扩张型心肌病(DCM)相关HAND1基因新突变.方法 自2013年2月至2017年2月在复旦大学附属第五人民医院和上海交通大学附属胸科医院采集120例散发性DCM患者和200名健康对照者的临床资料和外周静脉血标本,提取基因组DNA.通过聚合酶链反应扩增HAND1基因编码外显子并进行测序分析以发现HAND1基因新突变.分别应用在线软件MUSCLE和MutationTaster分析突变氨基酸在进化上的保守性和突变的致病性.克隆野生型HAND1基因,通过定位诱变获得其突变体,转染HeLa细胞,应用双荧光素酶报告基因分析试剂盒分析突变型HAND1的功能特点.结果 在1例散发性DCM患者发现1种新的杂合性HAND1基因突变c.346G＞T,即p.E116X突变.该无义突变不存在于200名健康对照者,多物种HAND1蛋白序列比对显示第116位的谷氨酸在进化上高度保守,致病性预测表明所识别的HAND1基因突变具有致病性.生化分析证实突变型HAND1对靶基因的转录激活功能丧失.结论 HAND1基因功能缺失性突变可能是散发性DCM的少见病因.
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先天性心脏病相关HAND1基因新突变研究
目的:研究先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)相关HAND1基因新突变.方法:入选CHD患儿136例及健康对照儿童200名,抽提基因组DNA,通过聚合酶链反应测序筛查HAND1基因突变.应用计算机软件评估突变氨基酸的保守性并预测突变的致病性,应用双荧光素酶报告基因分析系统分析突变对HAND1功能的影响.结果:在1例法洛四联征患儿发现1种新的HAND1基因杂合突变,其编码核苷酸序列第389位的胸腺嘧啶突变为鸟嘌呤(c.389T>G),相应氨基酸序列的第130位亮氨酸变为精氨酸(p.L130R).该突变改变了进化上保守的氨基酸序列并被预测为有致病性,功能研究揭示突变型HAND1的转录激活功能显著降低.结论:该HAND1基因功能缺失性新突变可能是CHD的少见分子病因.
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大鼠SCN5A基因内含子1+204 bp～+757 bp转录调控功能分析
目的 克隆大鼠心肌SCN5A基因5'端调控区,检测目的片段在HEK293细胞中的转录活性.方法 扩增大鼠心肌SCN5A基因+204 bp～+757 bp、+204 bp～+385 bp和+204 bp～+329 bp片段,构建含目的片段的荧光素酶报告基因--pGL3-P0、pGL3-P1和pGL3-P2,比较HEK293细胞中荧光素酶活性,评价不同长度DNA片段的转录调控活性.结果 成功构建大鼠心肌SCN5A基因5'端3个片断的荧光素酶报告基因,HEK293细胞中pGL3-P1相对荧光素酶活性分别为pGL3-P0、pGL3-P2的4.3倍和2.8倍.结论 SCN5A基因内含子1目的片段在HEK293细胞中具有较强的转录调控活性;SCN5A基因+329 bp～+385 bp为正凋控区,软件分析MZF1、USF、C-ETs-1等因子能与这些正调控区域结合并可能参与SCN5A基因的表达调控.
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CCR5基因5′侧翼区的克隆及调控功能初步研究
目的:研究CCR5基因5′侧翼区的调控序列.方法:分段构建CCR5基因5′侧翼区的pCAT报告基因载体;分析各片段在Hela细胞中的CAT调节活性.结果:CCR5基因5′侧翼区基因-1～-486 bp序列的pCAT重组质粒在Hela细胞中能明显表现CAT上调活性,其活性比pCAT enhancer vector的活性高3倍.结论:CCR5基因5′侧翼区基因-1～-486 bp序列中存在基因转录上调元件.
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热休克诱导细胞周期素D1表达水平降低的转录调控机制
目的:研究人的细胞周期素D1基因启动子热休克效应的表达调控机制.方法:以RT-PCR技术研究细胞周期素D1mRNA水平的变化;构建一系列人细胞周期素D1基因启动子报告基因质粒.通过报告基因方法确认细胞周期素D1启动子的热休克效应区.应用染色质免疫沉技术检测核心启动子区域的组蛋白乙酰化修饰情况.结果:热休克造成细胞周期素D1mRNA水平下降;报告基因结果显示人细胞周期素D1基因的热休克的效应区位于-50～+141 bp范围.核心启动子区组蛋白H3第九位赖氨酸乙酰化程度降低.结论:热休克抑制人的细胞周期素D1基因的启动子转录活性,其效应区位于核心启动子的-50～+141 bp范围.热休克效应与核心启动子区的组蛋白乙酰化程度下降有关.
