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微囊藻毒素-LR诱导的恶性转化肝细胞miRNA表达谱的变化
目的 构建微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)诱导的人永生化肝细胞株(WRL68细胞)恶性转化模型,检测miRNA表达谱,寻找差异表达的rniRNA.方法 用10 nmol/L MC-LR对WRL68细胞进行连续染毒至第25代,进行软琼脂集落形成实验及裸鼠成瘤实验.通过miRNA芯片技术检测和分析对照WRL68细胞和恶性转化细胞的miRNA表达谱;采用实时荧光定量PCR对芯片结果加以验证;应用TargetScan在线软件预测miRNA可能调控的靶基因.结果 第25代MC-LR染毒组细胞在软琼脂中可以形成集落,能在裸鼠皮下形成肿瘤.芯片检测分析显示,表达差异显著的miRNA有54个,表达上调有35个,表达下调有19个.实时荧光定量PCR结果显示,hsa-miR-140-3p、hsa-miR-19b-1-5p、hsa-miR-203a和hsa-miR-494均下调(P＜0.05),与芯片检测结果趋势一致.以生物信息学技术分析miR-494可能调控的靶基因,结果预测到3个与肿瘤相关的潜在靶基因,分别是肿瘤坏死因子受体相关因子3 (TNF receptor-associated factor 3,TRAF3)、微管相关肿瘤抑制基因(microtubule associated tumor suppressor1,MTUS1)和结肠癌转移相关基因(metastasis associated in colon cancer1,MACC1).结论 MC-LR诱导肝细胞恶性转化过程中可引起miRNA表达谱发生显著改变,差异表达的miRNA可能在肝细胞恶性转化过程中起着重要作用.
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慢病毒介导的稳定过表达人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基基因的WRL68细胞株构建
目的 利用慢病毒载体构建稳定过表达人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的WRL68细胞株.方法 采用PCR方法合成GCLC基因全长,经NotⅠ、NsiⅠ酶切后克隆到慢病毒载体LV6上;采用PCR、酶切、测序鉴定重组质粒LV6-GCLC;将重组质粒转染293T细胞,收集培养上清并感染WRL68细胞,经嘌呤霉素筛选出稳定过表达细胞株.采用增强型绿色荧光蛋白检测转染情况,采用Real-time PCR及Western blotting鉴定所构建的细胞株;MTT法检测细胞活性;采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞谷胱甘肽(GSHl)含量.结果 PCR、酶切及测序结果表明重组慢病毒载体构建成功;重组慢病毒转染293T细胞后可观察到荧光及蛋白表达,包装过表达慢病毒并检测其浓缩滴度为1.0× 109 TU/ml;用1μg/ml嘌呤霉素成功筛选出稳定过表达细胞株;GCLC过表达组中GCLC的mRNA和蛋白的表达量高于空载体转染组及对照组(P＜0.05);GCLC过表达组、空载体转染组及对照组的细胞活性间比较,差异无统计学意义(P＞0.05);GCLC过表达组GSH含量明显高于空载体转染组及对照组(P＜0.05).结论 成功构建了稳定过表达人GCLC的WRL68细胞株.
