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多药耐药相关蛋白4过表达对脂多糖诱导血管内皮高渗透性的影响及其机制
目的 探讨多药耐药相关蛋白4(MRP4)基因过表达对脂多糖(LPS)诱导大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)渗透性的影响及其分子机制.方法 体外培养PMVECs细胞,待细胞传至3~6代后分为3组:LPS组无血清培养基培养24 h后,用10μg/mL LPS刺激细胞;Ad-shRNA组用腺病毒空白载体转染细胞2 h,无血清培养基培养24 h后,用10μg/mL LPS刺激细胞;Ad-MRP4组用携带MRP4的重组腺病毒载体转染细胞2 h,无血清培养基培养24 h后,用10μg/mL LPS刺激细胞.于LPS刺激2、6、12、24 h采用Transwell小室法检测单层细胞渗透性;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平;激光共聚焦荧光显微镜下观察细胞内纤维型肌动蛋白(F-actin)形态及分布情况.于LPS刺激12 h收集细胞,采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测PMVECs中MRP4、β-连环蛋白(β-catenin)、血管内皮-钙黏蛋白(VE-cad)和紧密连接蛋白(ZO-1)的表达水平.结果 ①LPS刺激后PMVECs细胞渗透性及细胞内cAMP水平逐渐增加,12 h达到高峰,24 h开始下降.用携带MRP4的重组腺病毒载体转染PMVECs后,细胞渗透性较LPS组及Ad-shRNA组显著增加〔12 h渗透性(A值):1.88±0.06比1.12±0.17、1.10±0.18〕,细胞内cAMP水平显著降低〔12 h cAMP(μg/L):2.39±0.02比2.97±0.01、3.00±0.02,均P<0.05〕;而LPS组与Ad-shRNA组各时间点各指标差异均无统计学意义(均P>0.05).② 激光共聚焦荧光显微镜下显示,3组细胞均出现F-actin重构、应力纤维形成,但Ad-MRP4组细胞破坏程度较LPS组和Ad-shRNA组更加严重.③ 与LPS组和Ad-shRNA组比较,Ad-MRP4组PMVECs中MRP4蛋白表达显著上调(灰度值:0.76±0.03比0.44±0.02、0.43±0.02,均P<0.05),β-catenin、VE-cad和ZO-1蛋白表达显著下调〔β-catenin(灰度值):0.14±0.03比0.23±0.04、0.23±0.03;VE-cad(灰度值):0.21±0.01比0.34±0.02、0.35±0.04;ZO-1(灰度值):0.14±0.02比0.37±0.06、0.33±0.07,均P<0.05〕;而LPS组与Ad-shRNA组间各蛋白表达差异无统计学意义(均P>0.05).结论 MRP4基因过表达可降低细胞内cAMP水平,下调细胞间连接蛋白表达,从而增加LPS诱导的血管内皮渗透性.
