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范可尼贫血患者FANCA突变子的构建及其功能
目的 研究范可尼贫血(FA)患者FANCA蛋白的表达及其突变子的功能.方法 用3例来源于FA-A型患者的外周血淋巴细胞建立的细胞系作为研究对象,分别提取其细胞总蛋白、细胞胞质蛋白和细胞核蛋白,用Western blot法分析FANCA蛋白的表达及其在细胞胞质和细胞核内的分布,对1例有FANCA截短型蛋白表达的FA患者,构建了质粒突变子并用哺乳动物细胞双杂交方法检测FANCA基因突变子(外显子5缺失)与FANCG蛋白的相互作用.结果 用兔抗人抗体检测时,3例FA-A患者均无FANCA蛋白的表达,而用鼠抗人抗体检测时,有1例患者可检测到截短型FANCA蛋白表达,但此截短型FANCA蛋白不能从细胞胞质转运到细胞核,也不能在哺乳动物细胞双杂交系统中与FANCG蛋白相互作用.结论 3例FA-A患者中,2例无FANCA蛋白表达,1例可表达截短型FANCA蛋白,但无正常FANCA蛋白功能,进一步证实其FANCA基因突变为致病性病理突变,FANCA基因外显子5参与了与FANCG的相互作用.
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利用RNA干扰技术沉默p53基因突变子175H的效果评价
目的:在p53基因缺失型细胞株H1299中转染p53基因突变子175H,构建H1299-175H细胞模型,并观察小发夹环RNA(shRNA)的基因沉默效果.方法: 采用引物重叠PCR定点突变技术合成p53基因突变子175H,并利用基因重组技术构建出表达载体,以脂质体转染法建立细胞模型;合成针对p53-175H的shRNA 并构建出反转录病毒表达载体Psupe-175HR,应用磷酸钙共沉淀法导入包装293T细胞,并收集假病毒颗粒感染H1299细胞.应用Western blotting法检测P53蛋白表达.结果:转染p53基因突变子175H的H1299-175H细胞模型P53蛋白表达阳性;H1299-175H细胞模型转染shRNA后,P53蛋白表达下调.结论:成功构建H1299-175H细胞模型;构建的Psuper-175HR基因沉默载体可以有效地抑制p53基因突变子175H的表达.
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p53基因突变子175 H、248 W和273 H的定点突变及表达载体的构建
目的:定点诱变合成p53基因突变子进而构建表达载体.方法:以野生型p53基因为模板,采用PCR体外定点突变技术,设计2对引物,将突变位点设计在引物上,通过重叠延伸法2次PCR扩增,扩增片段上含有所需要的突变位点,后将扩增片段克隆入pcDNA3.1载体中.结果:在预期位点已经发生突变,p53基因第175位密码子由精氨酸(cgc)突变为组氨酸(cac),第248位密码子由精氨酸(cgg)突变为色氨酸(tgg),第273位密码子由精氨酸(cgt)突变为组氨酸(cat).p53基因突变子表达载体成功构建.结论:PCR技术诱导定点突变准确、高效.基因突变体的成功构建,为进一步研究该突变位点奠定了基础.
