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携TGFβ 1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体的构建与鉴定
目的:构建携TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体.方法:以逆转录病毒pRevTRE为载体,采用平末端连接法获得含人TGFβ1cDNA 3'-端活性肽编码基因正、反向插入的重组病毒质粒,脂质体介导转染包装细胞PA317,获得含TGFβ1正、反义RNA的复制缺陷型逆转录病毒载体pRevTβ和pRevTβ-AS,感染NIH3T3细胞,测定病毒滴度.分别转染膀胱癌 EJ 细胞,通过Southern-blot和半定量RT-PCR方法评价载体整合及表达效率.结果:pRevTβ、pRevTβ-AS载体病毒滴度分别为0.84、0.88×105CFU/ml,EJ 细胞外源基因的整合率为100%,正、反义基因转染细胞内TGFβ1mRNA的相对转录水平为1.89和0.35.结论:构建的携TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体符合细胞体外转染要求,能与肿瘤细胞高效整合,有效表达.
关键词： 转化生长因子β1 复制缺陷型逆转录病毒载体 反义RNA -
携TGFβ1正、反义基因载体对膀胱癌细胞体外生长的作用
目的:探讨表达TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体,对人膀胱癌细胞生长及细胞周期调控的作用.方法:以逆转录病毒pRevTRE为载体,构建表达TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体pRevTβ和pRevTβ-AS;分别转染膀胱癌细胞株EJ,观察不同载体对膀胱癌细胞体外增殖、克隆形成和细胞周期时相的影响.结果:pRevTβ、pRevTβ-AS载体病毒滴度分别为0.84、0.88×105CFU/ml,对EJ细胞的整合率为100%,并有效表达;抑制TGFβ1表达可以降低靶细胞的生长速度和克隆形成率,同时出现G0/G1期细胞比例增高和S期细胞比例降低.结论:携TGFβ1反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体可以下调EJ细胞内源性TGFβ1表达,诱导肿瘤细胞G1期阻滞,抑制肿瘤细胞体外生长增殖.
