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以人乳头瘤病毒16 L1为载体的流感通用疫苗初步研究
目的 构建以人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16 L1为载体的甲型流感病毒M2基因胞外区(M2e)通用疫苗杆粒,利用昆虫细胞杆状病毒表达系统,进行初步的蛋白表达.方法 利用PCR技术将甲型流感病毒M2e基因序列与HPVl6 L1相连.经酶切、酶联将融合基因插入pFastBacHTA载体,在DH10Bac细胞中进行同源重组,经测序鉴定后构建M2e-HPV16 L1杆粒,脂质体转染sf9昆虫细胞,收获并扩增含有M2e-HPV16 L1的杆状病毒,经扩增后获得高效价的重组杆状病毒,用SDS-PAGE、免疫荧光法和电镜检测目的蛋白的表达.结果 构建了以HPV16 L1为载体的M2e通用疫苗杆粒,通过转染sf9昆虫细胞得到初步M2e-HPV16 L1融合蛋白表达.结论 成功构建了HPV16 L1与甲型流感病毒M2e融合蛋白的病毒样颗粒,为流感通用疫苗的研制奠定了基础.
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昆虫细胞杆状病毒表达系统表达重组人类ZP3蛋白的研究
目的:探讨利用重组表达系统制备重组人类ZP3(hZP3)蛋白的方法和技术难点,为hZP3蛋白的制备和应用打下技术基础. 方法:构建hZP3的载体质粒pFASTBAC HTa-hZP3,在大肠杆菌宿主细胞中利用杆状病毒Bac-to-Bac系统同源重组构建重组的杆状病毒穿梭载体Baemid,用重组的Bacmid转染Sf9细胞制备重组杆状病毒,分别表达带HIS标签的hZP3全长蛋白(氨基酸1～424)和截短的hZP3蛋白(氨基酸23～ 348).摸索重组hZP3蛋白的表达时间和纯化制备方法. 结果:成功制备了表达重组人hZP3全长蛋白和截短体蛋白的Bacmid和杆状病毒颗粒,Western印迹检测表明,在Sf9细胞中较好的表达时间段为感染后72 ～96 h.重组表达的hZP3蛋白可以部分被钴柱亲和纯化,大量的重组hZP3蛋白不能结合到亲和介质而流穿,但确切的原因还未知.纯化得到的hZP3经荧光素Dylight Dye488标记,能与人精子结合. 结论:利用昆虫细胞杆状病毒表达系统表达hZP3蛋白是可行的,可以进一步优化,但hZP3蛋白的有效富集和纯化方法是大的瓶颈,还需要进一步摸索.
关键词： 人ZP3 精子 重组蛋白 昆虫细胞杆状病毒表达系统 -
亚洲1型口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因在昆虫细胞中的共表达
目的 在昆虫细胞中表达亚洲1型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,为进一步研究FMDV空衣壳抗原和疫苗奠定基础.方法 从质粒pTOP-P1-2A和pTOP-3C中分别扩增出编码亚洲1型口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和3C蛋白酶基因,构建转移载体pDual-P1-2A-3C并与大肠杆菌(Escherichia coli)DH10Bac中的Bacmid质粒重组,构建重组转座质粒rBacmid-P1-3C.在脂质体介导下将rBaemid-P1-3C转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒.在Sf9昆虫细胞中共表达P1-2A和3C蛋白,通过SDS-PAGE、Western blot和Dot-ELISA试验鉴定重组蛋白.结果 目的基因在昆虫细胞中得到了正确的表达,表达蛋白与抗亚洲1型FMDV血清发生特异性反应.有良好的抗原性.结论 成功在昆虫细胞中表达亚洲1型口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因.
关键词： 口蹄疫病毒 衣壳蛋白 昆虫细胞杆状病毒表达系统 表达
