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养阴活血汤早期干预对大鼠肺间质纤维化的影响
目的 观察养阴活血汤对博莱霉素诱导的大鼠肺间质纤维化疗效以及对转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)mRNA表达的影响.方法 96只雌性Wistar大鼠,随机分为正常组、模型组、中药组和干扰素β1a(interferon-β1a,IFN-β1a)组.气管内注入博莱霉素A2建立大鼠肺间质纤维化模型.中药组自造模次日始,每只大鼠灌胃浓缩中药每天20 ml/kg,IFN-β1a组皮下注射重组人IFN-β1a 4.6μg/kg,每周3次.正常组和模型组等体积生理盐水灌胃.各组大鼠在实验周期第3天、第7天、第14天和第28天腹主动脉放血法处死,进行肺系数检测,HE和VG染色.原位杂交测定大鼠肺组织中TGF-β1和CTGF的mRNA表达情况.结果 养阴活血汤能明显降低肺系数,使肺组织的病理改变减轻,可以减弱大鼠肺组织和原代培养肺成纤维细胞中TGF-β1 mRNA和CTGF mRNA的表达强度.结论 养阴活血汤可以减少TGF-β1 mRNA和CTGF mRNA的表达量,减弱细胞因子对肺间质纤维化的促进作用,从而起到抑制肺间质纤维化的作用.
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干扰素β1a基因真核表达质粒的构建和表达
目的:构建干扰素β1a(IFN-β1a)的CHO表达体系,探讨人IFN-β1a在真核细胞中的表达效果.方法:采用全基因合成法获取重组人IFN-β1a基因,并通过点突变将IFN-β1a的17位半胱氨酸进行修饰,合成的基因经PCR扩增,连接入pSV2-dhfr质粒中,构建重组真核表达质粒pSV2-dhfr-IFN-β1a.将质粒转染至CHO-dhfr-细胞中,经MTX加压筛选,获得稳定生长的能够持续表达IFN-β1a的单克隆细胞株；提取细胞基因组DNA,进行PCR鉴定.收集细胞培养上清液,采用Wish细胞病变抑制法检测转染细胞中IFN-β1a的抗病毒活性.结果:重组真核表达质粒pSV2-dhfr-IFN-β 1a经PCR及双酶切鉴定证明构建正确；以转染细胞基因组DNA为模板,可扩增出IFN-β1a基因；转染后重组细胞表达的IFN-β1a具有抗病毒活性,达到3×105 IU·mL-1.结论:IFN-β1a基因真核表达质粒构建成功,并在CHO细胞中成功表达了具有较高生物学活性的IFN-β1a蛋白.
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生物反应器培养分泌重组人干扰素β 1a的CHO细胞工艺的建立
目的 建立生物反应器培养分泌重组人干扰素β1a(IFNβ1a)的CHO细胞的工艺,探讨CHO细胞表达分泌IFNβ1a的反应动力学规律.方法 应用15L生物反应器悬浮微载体方式培养CHO工程细胞,比较不同时期细胞的生长形态、数量、生物活性、灌流量、葡萄糖消耗量及其他物理参数的变化规律.结果 15L生物反应器中在初始pH 6.86～7.20,溶氧30％～ 70％,温度36.8 ～ 37.2℃,微载体4 g/L,罐流量6.5 L/h的条件下连续培养40 d,CHO工程细胞的密度维持在5×105个/ml之间,收获的细胞液中重组人IFNβ1a的生物活性为2.5×104～4.0×105 IU/ml,葡萄糖消耗量在0.5～2.5 mg/ml之间.结论 初步建立了15 L生物反应器培养分泌重组人IFNβ1a的CHO细胞的工艺,为进一步建立工业化生产工艺奠定了基础.
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重组人干扰素β1a生物学活性MTS/PMS检测方法的建立
目的 建立重组人干扰素β1a(Recomhimant human interferon beta1a,rhIFNβ1a)生物学活性MTS/PMS检测方法.方法 将MTS和PMS偶联作为染色液,建立IFNβ1a生物学活性检测方法,对细胞浓度、细胞病变时间、MTS工作浓度和染色时间进行优化,并绘制效应曲线.对建立的方法进行重复性、准确性验证,并与结晶紫染色法进行比较.结果 优化后的MTS/PMS法的佳反应条件为:细胞浓度1×105个/ml,细胞病变时间24～36h,MTS工作浓度2mg/ml,染色时间40 min；A570/630值与IFNβ1a保护Wish细胞S型效应曲线的相关系数(R2)均达0.99以上.不同检测板、相同加样位置的变异系数在6％～20％之间；相同检测板、不同加样位置的变异系数在13％～17％之间；检测IFNβ1a细胞收集液的回收率在86％～ 121％之间.该法检测rhIFNβ1a生物学活性效应曲线呈反“S”型,线型较好,R2值均在0.99以上,均比结晶紫染色法的R2值高,且比结晶紫染色法更稳定.结论 已建立了rhIFNβ1a生物学活性MTS/PMS检测方法,适用于常规定量测定rhIFNβ1a的生物学活性.
关键词： 干扰素β1a 生物学活性 MTS/PMS染色法
