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麻疹H基因克隆及表达条件优化
目的 克隆麻疹H蛋白基因,构建重组表达质粒,诱导表达蛋白.方法 麻疹Edmonston株减毒活疫苗中提取基因组RNA,RT-PCR扩增H基因.用限制性内切酶EcoR I和HindⅢ双酶切H蛋白基因片段和pET30a(+)载体,连接后获得重组质粒MV-H-pET30a(+),转化至BL21(DE3),IPTG诱导表达.结果 RT-PCR扩增片段长度约为1 900 bp,与MV-H基因相符.MV-H-pET30a(+)测序结果显示:MV-H基因对码正确,核苷酸序列符合率达99.7%.SDS-PAGE结果表明,菌体中含有特异性蛋白,大小约为86kD.结论 在pET30a(+)成功克隆麻疹H基因,并有目的 蛋白表达.
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犬瘟热病毒H基因原核表达载体的构建
利用本实验以前构建的含有犬瘟热病毒H基因的pMD18-T质粒,根据pMD18-T-H序列设计带有Xba1 Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的引物,对H基因进行PCR扩增,得到约1800bp左右的片段.该片段被克隆到pMD18-Tsimple载体上,用Xba1 Ⅰ和Hind Ⅲ进行单、双酶切鉴定,筛选阳性克隆.将阳性克隆再用Xba1 Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切,纯化回收CDVH基因片段.将原核表达载体pPROEXTMHTa、pet-30b用同样的方法酶切,回收载体片段.将CDV H基因片段分别用T4连接酶连接到回收的pPROEXTMHTa、pet-30b载体上,构建原核表达载体质粒pPROEXTMHTa-H和pet-30b-H.再用Xba1 Ⅰ和Hind Ⅲ进行单、双酶切鉴定阳性载体.本实验为下一步H蛋白表达、纯化并作为CDV诊断用抗原及CD的免疫预防奠定了基础.
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麻疹病毒S191疫苗株H基因序列遗传变异分析
目的 研究麻疹病毒(MeV)疫苗株Shanghai191(S191)毒种和传代病毒血凝素蛋白(H)基因稳定性及其遗传与变异特点;对该序列一些重要位点的氨基酸进行比较,推测其功能结构及生物学活性变化;探讨S191疫苗株的保护效果.方法 利用逆转录-聚合酶链反应方法扩增S191减毒株MeV23、MeV26、MeV27、MeV29、MeV32和MeV37代H基因.测序后与GenBank上U03663的序列进行比对分析.结果 S191传代病毒与U03663序列之间核苷酸同源性达99.9%以上,氨基酸同源性为100%;S191与中国流行株的氨基酸序列同源性为96.6%～96.8%;S191与其他流行株之间氨基酸同源性达96.4%～98.9%.结论 S191及生产的疫苗具有弱毒稳定性和安全性,并具有好的保护作用.
