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熊猫等动物犬瘟热病毒附着蛋白基因的遗传多样性
为了研究犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)大熊猫株、小熊猫株和长春犬株附着蛋白(H)基因的遗传变异,对H基因进行了序列测定.上述3个CDV毒株的H基因全长均为1?946bp,开放阅读框架(ORF)始于21～23位的ATG,终止于1?842～1?844位的TGA,编码607个氨基酸.与GenBank中15个CDV株推导的H蛋白氨基酸序列比较发现,16个野毒株潜在的N-联糖基化位点为8或9个,而疫苗株Onderstepoort和Convac分别为4个和7个,其中309～311位氨基酸所形成的潜在的糖基化位点是疫苗株没有而野毒株共有的,N-联糖基化位点的不同可能影响H蛋白的抗原性.用DNASIS软件分析H基因的系统发生,其中野毒株组成一组,该组又分成5个谱系,分别为GP、LP、MINK,2544、404、4513、DANDOG,A92-6、LEOP、JAVE、RACC、AMEDOG,HAMA、UENO,GREEN、LIU谱系;而疫苗株与野毒株H基因之间存在明显的差异,组成了另一组,上述结果表明CDV H蛋白基因存在基因型的差别,具有广泛的遗传多样性.
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犬瘟热病毒细胞膜受体的鉴定
犬瘟热病毒(CDV)敏感细胞Vero用SDS或RIPA溶解缓冲液溶解,利用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)鉴定犬瘟热病毒疫苗株(CDV-onderstepoort)的细胞受体.结果发现,在Vero细胞上有两组CDV结合蛋白质,即高分子量组蛋白质(127kD、120kD、110kD)与低分子量组蛋白质(27kD和30kD).这些CDV结合蛋白组分的性质及在CDV致病中的作用有待进一步研究.
关键词： 犬瘟热病毒 病毒受体 病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA) -
犬瘟热减毒疫苗对小熊猫安全性与免疫原性研究
犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)是副粘病毒科麻疹病毒属成员,与麻疹病毒和牛瘟病毒亲缘关系很近,其基因组为不分节、非重叠的负链RNA,长15 960bp,由6个基因组成,编码N、P、M、F、H、L蛋白.此外,还包括由P基因编码的V和C蛋白[1].由CDV感染引起的犬瘟热,是一种急性、高度接触性传染病,主要引起犬科、鼬科和浣熊科动物的犬瘟热(CD),但是伴随生态环境的变化和犬瘟热病毒对动物流行病因素的适应,它的自然感染宿主范围在不断扩大,危害也越来越大.大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)是我国特产的世界级珍稀濒危动物,由于大熊猫具有极高的科研和观赏价值,成了世界人民保护自然资源的象征.近年来有大熊猫发生CD的报道[2],研究大熊猫CD的预防是必要的.小熊猫作为浣熊科的动物,对CDV非常敏感[3].本研究通过犬瘟热减毒疫苗对小熊猫安全性与免疫原性研究,探讨小熊猫作为评价犬瘟热弱毒疫苗对大熊猫的安全性与免疫原性动物模型的可能性.
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犬瘟热病毒M蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备
目的 对犬瘟热病毒(CDV)弱毒株M基因进行克隆及原核表达,并制备鼠抗CDV M蛋白多克隆抗体.方法 针对犬瘟热病毒弱毒株(CDV-LP)的M基因序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-30a(+)并转化至宿主菌BL21(DE3),在0.4 mmol/L IPTG和37℃条件下诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定.以纯化的M蛋白免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后采血,分离血清,制备鼠抗CDV M蛋白多克隆抗体.结果 通过RT-PCR成功扩增出大小为1 014 bp的CDV M基因,构建的重组质粒pET-30a(+)-M在大肠埃希菌中诱导表达出分子质量单位为43 ku的重组M蛋白,与预期值相符;重组蛋白主要以包涵体形式表达,Western blot检测显示M重组蛋白能被抗CDV多克隆抗体识别;免疫小鼠制备的多抗能与纯化的重组蛋白发生特异性反应.结论 本研究成功构建了pET-30a(+)-M并表达了CDV M蛋白,制备了鼠多克隆抗体,为建立CDV M蛋白的ELISA抗原检测方法,鉴定表达M蛋白的重组杆状病毒奠定了基础.
关键词： 犬瘟热病毒 原核表达 M蛋白 Western blot 多克隆抗体 -
犬瘟热病毒检测方法研究进展
犬瘟热病毒属副粘病毒科麻疹病毒属成员,食肉目各科动物均有感染报道,但主要感染犬、狼、貂、狐等动物,发病率、死亡率较高,给养殖业带来巨大的经济损失.因此注射疫苗、尽早诊断本病并及时采取相应的防治措施是减少损失的有效手段.本文阐述了犬瘟热病毒的检测方法,以期为该病毒的研究提供参考.
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法匹拉韦在细胞水平上对犬瘟热的抑制作用初探
目的 研究法匹拉韦(T-705)在细胞水平上对犬瘟热病毒(CDV)增殖的抑制效果.方法 利用间接免疫荧光实验及50％终点法测定犬源CDV-11株与貂源CDV-3株在Vero细胞和DH82细胞中的生长曲线.采用CCK-8法测定T-705对Vero细胞及DH82细胞活力的影响;测定在不同时间加入不同浓度T-705对CDV的抑制效率.结果 细胞毒性实验表明,T-705对Vero细胞的活性具有轻微抑制作用,对DH82细胞的活性基本无影响.在2.441～1250μg/ml实验范围内,T-705可有效抑制CDV-3和CDV-11在Vero及DH82细胞中的增殖.在细胞感染病毒后的不同时间点(12,24,36,48 h)加入T-705,仍可产生持久的抗病毒效果.结论 T-705可在细胞水平高效抑制CDV的增殖,是治疗犬瘟热的候选药物.
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犬瘟热病毒N蛋白抗原表位基因的合成和杆状病毒表达载体的构建
目的 串联合成犬瘟热病毒N蛋白抗原表位基因,并构建其杆状病毒表达载体.方法 利用生物信息学软件,预测N蛋白的抗原表位,串联合成这些抗原表位.利用定向克隆的方法,将该基因片段连接到杆状病毒表达载体pFastBac-Hta.结果 获得了包含犬瘟热病毒N蛋白抗原表位的基因,并成功构建pFastBac-N合成表达载体.结论 该实验为犬瘟热病毒N蛋白抗原表位基因在杆状病毒内的表达奠定了基础.
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犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立与应用
根据Barrett发表的犬瘟热病毒(CDV)Onderstepoort弱毒株融合蛋白(F)基因序列,设计合成了一对寡聚核苷酸引物,并以南京农业大学惠赠的Onderstepoort标准株反转录产物为模板,建立了CDV的RT-PCR方法,并应用于CDV的诊断.结果表明,以该对引物,只能从CDV-ONP标准株反转录产物中扩增出大小为324bp的核苷酸片段,与理论设计值大小一致,而正常Vero细胞和同为副粘病毒科的新城疫病毒(NDV)作为对照,病毒扩增结果为阴性.RT-PCR可检出1μl作106倍稀释的CDV-ONP标准株反转录产物,说明其具有很高的敏感性.应用试验结果,可从感染CDV犬的组织病料中提取RNA,反转录产物中也扩增出324bp的核苷酸片段.通过本研究不仅建立了敏感性、特异性好的CDV的RT-PCR检测方法,也为F基因的克隆和序列测定及表达奠定了基础.
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狐狸感染犬瘟热病毒并发华支睾吸虫的病理学诊断
犬瘟热是由犬瘟热病毒(Canine Distempervirus,CDV)引起的犬科、鼬科及部分浣熊科动物的高度接触传染、致死性传染病.犬瘟热在我国已有悠久历史,从60年代开始,国内部分省区的毛皮动物饲养场不断发病,并逐渐在全国范围内流行.国内一些学者分别从水貂、貉子和犬群中检出CDV[1 ].本实验从山东省滨州地区送检的养殖狐狸中用特异性免疫组织化学方法检出CDV,同时根据其流行病学、临床症状、病理学检查以及寄生虫检查结果,确诊为CDV感染并发华支睾吸虫感染.
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犬瘟热的神经性病理机制
犬瘟热病毒(Canine distemper,CDV)可以诱发犬产生严重的免疫抑制和神经性疾病,例如脱髓鞘脑脊髓炎(demyelinating leukoencephalitis,DL),脱髓鞘是具有代表性的神经性病症.犬瘟的神经病理机制研究发现,在脱髓鞘急性损伤期,少突胶质细胞代谢障碍及小胶质细胞活化;在脱髓鞘的慢性期,免疫系统逐渐恢复,在脱髓鞘斑区发生炎症,促使损伤的恶化.研究发现:犬瘟热病毒可以存在于炎性脱髓鞘损伤区外且逃避免疫识别,这是慢性炎症性脱髓鞘损伤的主要机制,而逃避免疫识别的机制是病毒的非溶细胞性的选择性传播及限制性的感染.
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表达犬CD150的Vero细胞系的建立
目的 建立表达CD150基因的非洲绿猴肾细胞系Vero-CD150,提高犬瘟热病毒的分离效率.方法 分离健康犬血液中的白细胞,并克隆编码CD150的基因,构建真核表达质粒pIRES-CD150,将该质粒转染Veto细胞系.经过克隆化筛选获得Vero-CD150细胞系.利用RT-PCR、流式细胞仪(FCM)进行鉴定,同时对临床检测为阳性的自然发病犬,取肝、肺、脾脏等脏器为病料,接种于Vero-CD150细胞系.结果 RT-PCR和流式细胞仪皆检测到CD150在Vero细胞中能够稳定表达;与Veto细胞系相比,Vero-CD150细胞系的生长特性相似;接种病料后,感染细胞不仅产生明显的细胞病变,且用RT-PCR可检测到病毒核酸.结论 本试验使CD150基因能在体外转入正常的非洲绿猴肾细胞系Vero中,获得稳定表达CD150基因的Vero细胞亚克隆,并使后者结合CDV的能力明显增强.该细胞系的建立,为更有效的分离犬瘟热病毒打下了基础,可用于进一步研究.
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犬瘟热病毒RT-LAMP检测方法的建立和初步应用
目的 利用环介导等温扩增( LAMP)技术建立一种检测犬瘟热病毒感染的新方法.方法 根据GenBank中NP基因序列,设计4条LAMP特异性引物,对反应条件、特异性、可视化效果和应用效果进行研究.结果 在60℃等温的条件下、1h内可完成RT-LAMP扩增过程；特异性和可视效果良好；对63份临床标本进行检测,阳性检出率为71.4％(45/63),检出率高于RT-PCR的63.5％(40/63).结论 建立的RT-LAMP检测方法,显示了较高的特异性和敏感性,而且兼具高效、快捷、可视化的优势,为临床检测犬瘟热病毒感染提供了一种快速简便的新途径.
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犬瘟热病毒(CDV)ELISA检测方法的建立与应用
目的 建立犬CDV抗体ELISA检测方法.方法培养vero细胞,接种CDV病毒,制备vero正常抗原和CDV特异抗原,滴定酶结合物和抗原佳工作浓度,并进行精密性、敏感性、稳定性、特异性实验.结果正常、特异抗原和酶结合物佳工作浓度分别为1∶32 000、10 μg/mL和1∶8 000;正常、特异抗原批内变异系数分别为9.1%和5.8%,批间平均变异系数分别为8.8%和6.6%;检测灵敏度为1∶2 560;与犬细小病毒(CPV)、犬肝炎病毒(ICHV)均无交叉反应.稳定性试验相对偏差小于25%.结论建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强.可用于犬CDV抗体的检测.
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水貂阿留申病毒、肠炎病毒与犬瘟热病毒多重PCR检测方法的建立与应用
目的 水貂阿留申病、病毒性肠炎与犬瘟热并称影响水貂健康的三大疫病,拟建立一种可同时检测三种病毒的多重PCR检测方法.方法 针对三种病毒基因保守区分别设计了3对特异性引物,对貂阿留申病毒(ADV)和水貂肠炎病毒(MEV)的DNA模板和犬瘟热病毒(CDV)的RNA模板进行了多重PCR扩增和扩增条件优化.结果 PCR可同时扩增出601 bp(ADV)、205 bp(MEV)和451 bp(CDV)的特异性目的条带,敏感性试验表明低核酸检出量为ADV每微升2.67×104拷贝、MEV每微升3.02×104拷贝和CDV每微升1.72×105拷贝.临床样品检测结果表明多重PCR和单一PCR检测结果一致.结论 建立的多重PCR检测方法可快速地检测ADV、MEV和CDV单一或混合感染的临床样品.
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抗犬瘟热病毒噬菌体抗体库的构建
目的 构建抗犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)T7噬菌体单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)库.方法 用灭活CDV经皮下注射免疫犬,共3次,每次间隔2周,第3次免疫后2周采集犬外周血,分离淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,RT-PCR分别扩增犬IgG重链(heavy chain,VH)和轻链(light chain,VL)基因片段,通过SOE-PCR法将VH和VL用一段linker连接组装成scFv基因,经EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切后,连接到表达载体T7 Select 10-3b上,用包装蛋白包装后,以大肠埃希菌BLT5403为宿主菌进行增殖,随机挑取50个噬菌斑,进行PCR鉴定,并测定文库滴度.结果 扩增的VH和VL基因大小均与预期相符,测序结果经blast比对,扩增的片段与犬IgG的VH和VL序列匹配率达90％以上；所构建的原始文库滴度为3.2×107 pfu/ml,扩增后的文库滴度为5.0×108 pfu/ml.对随机挑取的50个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为94％.结论 成功构建了抗CDV的T7噬菌体抗体库,为犬科动物犬瘟热的防治提供了参考.
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水貂肠炎细小病毒及犬瘟热病毒灭活后的联合免疫效果
目的 探讨水貂肠炎细小病毒(mink enteritis virus,MEV)和犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)灭活后的联合免疫效果.方法 用甲醛灭活MEV-L和CDV-L弱毒株,固定MEV-L的血凝效价为26,与CDV-L病毒液(CDV-L TCID50 10-529/mL)分别按1∶1(Ⅰ组)、1∶2(Ⅱ组)、1∶3(Ⅲ组)的量混合,加入10％氢氧化铝胶,充分混匀后免疫大鼠,均为1 mL/只.分别于免疫前及免疫后第7、14、30、60、90天采血,分离血清,采用血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)试验和间接ELISA检测血清MEV抗体效价,血清中和试验和间接ELISA检测血清CDV抗体效价.结果 大鼠在免疫后7d时产生MEV和CDV抗体,30 d时抗体效价高,随后下降,90 d时抗体效价仍较高;Ⅰ组CDV抗体效价较其他两组高.结论 3组不同比例的CDV和MEV联合免疫大鼠均可产生较高的抗体水平,其中以1∶1比例的免疫效果佳.
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犬瘟热病毒H基因原核表达载体的构建
利用本实验以前构建的含有犬瘟热病毒H基因的pMD18-T质粒,根据pMD18-T-H序列设计带有Xba1 Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的引物,对H基因进行PCR扩增,得到约1800bp左右的片段.该片段被克隆到pMD18-Tsimple载体上,用Xba1 Ⅰ和Hind Ⅲ进行单、双酶切鉴定,筛选阳性克隆.将阳性克隆再用Xba1 Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切,纯化回收CDVH基因片段.将原核表达载体pPROEXTMHTa、pet-30b用同样的方法酶切,回收载体片段.将CDV H基因片段分别用T4连接酶连接到回收的pPROEXTMHTa、pet-30b载体上,构建原核表达载体质粒pPROEXTMHTa-H和pet-30b-H.再用Xba1 Ⅰ和Hind Ⅲ进行单、双酶切鉴定阳性载体.本实验为下一步H蛋白表达、纯化并作为CDV诊断用抗原及CD的免疫预防奠定了基础.
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Real-time TaqMan RT-PCR快速检测犬瘟热病毒方法的研究
按照犬瘟热(CDV)N基因序列,设计合成了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了Real-time荧光定量RT-PCR技术,对细胞培养物、肝脏、肺脏、脑、脾脏、淋巴结以及鼻腔拭子等组织病料中的CDV进行了特异性检测和敏感性试验.同时,利用建立的Real-time荧光定量RT-PCR方法与常规RT-PCR以及韩国BIOINDIST生产的BIT RAPID CDV检测试剂盒对57份临床样品进行了检测.结果:用20p mol/mL的引物浓度各1 uL和20 pmol/mL的探针浓度0.3 uL,获得的荧光信号强,曲线平滑.敏感性高,可检测到1.24×10-3 ng/uL的病毒RNA;特异性强,与NDV、AⅣ、NiPV等RNA病毒不发生交叉反应.试验重复性的变异系数(CV)分别为2.3%、2.5%和4.2%;与常规RT-PCR和BIOINDIST生产的BIT RAPID CDV检测试剂盒相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点.
关键词： 犬瘟热病毒 荧光定量RT-PCR Real-timePCR 检测 -
犬三种病毒疫苗对实验犬的保护效价的测定
用ELISA检测试剂盒和检测方法对上海某犬场的100份接种五联疫苗的实验犬血清进行犬传染性肝炎病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒病毒抗体的检测,以了解该病毒抗体是否达到保护效价,分析国内实验犬的疫苗使用情况.结果:接种一周后,97%实验犬的抗体则达到保护效价,一直到1年后仍有99%的实验犬的抗体有保护能力.
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犬瘟热病毒扬州分离株的生物学特性初步观察
从扬州地区经临床诊断疑似为犬瘟热的病犬组织块、白细胞、脑中分离到病毒,经鉴定为犬瘟热病毒(CDV),分别命名为CDV-YZ-0101株、CDV-YZ-0102株、CDV-YZ-0103株,并对其细胞病变规律、形态特征、细胞毒力、血凝活性、理化特性进行了研究.分离株在Vero细胞上均生长良好,传2～4代毒力稳定,CPE产生明显,TCID50分别为10-4.6～10-5.0/ml、10-4.4～10-4.9/ml、10-4.8～10-5.1/ml;空斑形成为0.4～0.6 mm,与参考株CDV-Ond各项特性基本相似.
