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重组质粒pcDNA-HA/ΔNp73α转染对人树突状细胞功能的影响
目的：研究转染pcDNA-HA/ΔNp73α重组质粒对树突状细胞（ DC）功能的影响。方法采取健康人脐带血，分离单个核细胞，置入含有白介素4（IL-4）和粒-巨细胞集落刺激因子（GM-CSF）的RPMI 1640完全培养基中培养。在培养第5、7天时收获DC细胞，加入FITC-anti-CD1a、PE-anti-CD83抗体，采用流式细胞仪检测CD1a、CD83表达情况。将DC分为正常培养至成熟的DC组（空白对照组）、空载体pcDNA-HA转染的DC组（阴性对照组）、ΔNp73α重组质粒转染的DC组（实验组）。分别在转染24、48、72 h后采用荧光显微镜检测转染效率；转染48 h后收获并提取细胞总RNA，采用RT-PCR检测转染后各组ΔNp73αmRNA表达情况；采用Western blotting检测转染DC的ΔNp73α蛋白表达水平；在收获的各组DC细胞中分别加入PE-anti-主要组织相容性复合体（ MHC-Ⅱ）、FITC-anti-CD40、PE-anti-CD80单克隆抗体，流式细胞仪检测CD40、CD80、MHC-Ⅱ表达情况；ELISA检测各组DC细胞白介素12（IL-12）分泌水平。结果 CD1a和CD83在培养第7天的表达水平均高于培养第5天（t=16.62、34.75，P<0.001）。DC于第7天诱导成熟。质粒转染DC后，24 h可见特异性绿色荧光蛋白表达，48 h荧光强，转染效率为38.2%，在48 h后，绿色荧光的表达逐渐减少。实验组在670 bp处可见阳性条带，为ΔNp73αmRNA阳性表达，而空白对照组和阴性对照组未检测到ΔNp73α mRNA的表达。在实验组中检测到ΔNp73α蛋白的表达，而正常对照组和阴性对照组中未检测到ΔNp73α蛋白的表达。各组CD40、CD80、MHC-Ⅱ表达水平比较，差异有统计学意义（F=12.68、41.18、38.95，P<0.05）；其中实验组CD40、CD80、MHC-Ⅱ表达水平均高于空白对照组和阴性对照组（P<0.05）。各组IL-12表达水平比较，差异有统计学意义（F=37.43，P<0.001）；其中实验组IL-12表达水平高于空白对照组和阴性对照组（ P<0.05）。结论从人脐带血中可成功分离DC；重组质粒pcDNA-HA/ΔNp73α转染DC促进其成熟，将有效提高DC的抗原提呈能力。
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Np73α基因转染树突状细胞抗乳腺癌细胞的免疫效应
目的：研究ΔNp73α基因转染树突状细胞（ DC）诱导的特异性抗乳腺癌免疫效应。方法：人脐带血细胞经GM-CSF、IL-4、TNF-α等细胞因子诱导培养DC，流式细胞仪（FCM）检测DC成熟前后CD1a、CD83的表达变化情况。脂质体法将pcDNA-HA／ΔNp73α转染至DC，经Western blot检测转染情况。转染DC与自体T细胞共培养诱导特异性CTL。 MTT法测定T细胞增殖能力；ELISA法检测IFN-γ的分泌水平；LDH释放法检测T细胞对乳腺癌细胞MDA-MB-231的杀伤作用。结果：DC诱导成熟后，CD1a表达约占56％，CD83约占74％，与未成熟DC（ CD1a 19％，CD8313％）比较，差异有显著统计学意义（ P＜0.01）。 Western blot检测到DC-ΔNp73α组有一特异条带表达。 DC-ΔNp73α组诱导的特异性CTL对MDA-MB-231杀伤作用高于DC组（ P＜0.05），而且刺激T细胞增殖能力增强，分泌IFN-γ的水平升高，与空载体DC-pcDNA组及DC组比较有显著统计学意义（P＜0.01）。结论：以ΔNp73α转染DC制备的DC疫苗，具有显著诱导CTL杀伤乳腺癌细胞的作用。
