深低温反复冻融杀伤人眼脉络膜黑色素瘤OCM-1细胞的机制
摘要： [目的]研究-70℃反复冻融体外杀伤人眼脉络膜黑色素瘤细胞系OCM-1的机制.[方法]OCM-1细胞反复冻融后,用噻唑蓝比色法及克隆形成实验检测细胞的杀伤情况和细胞生长活力,免疫组织化学方法检测细胞P16表达的变化,电镜及共聚焦显微镜观察冻融后细胞凋亡和坏死的形态学改变,并测定细胞的凋亡比率,流式细胞仪检测冻融前后细胞CD40表达比率及细胞膜电位的变化.[结果]噻唑蓝比色法检测及克隆形成实验显示,冻融可以直接杀伤OCM-1细胞,且残存的细胞生长能力也明显受抑制.免疫细胞化学染色见对照组的细胞呈P16阳性,而冻融后的细胞均呈阴性,冻融后培养的细胞部分呈阳性.电镜下观察到冰晶的结构特征及细胞的坏死和凋亡等变化.激光共聚焦显微镜观察发现凋亡细胞随着冻融次数的增加而增多.流式细胞仪测定显示冻融后细胞膜电位下降,冻融前后CD40阳性细胞比率差异明显,且呈一定的量效关系.[结论]冻融不仅可以明显杀伤OCM-1瘤细胞,还能抑制残存瘤细胞生长.反复冻融能诱导大量的肿瘤细胞发生凋亡,此为杀伤肿瘤及诱导肿瘤退变的直接原因,其机制与线粒体膜电位及P16表达下调有关.冻融后瘤细胞坏死因子CD40表达增强,可能是增强机体的免疫应答,介导机体免疫杀伤瘤细胞的机理.
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Ⅰ型登革病毒感染前后血管内皮细胞长链非编码RNA表达谱分析
[目的]运用高通量测序技术检测Ⅰ型登革病毒(DENV-1)感染人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)后长链非编码RNA(lncRNA)的差异表达,分析以探讨导致血管内皮细胞功能改变或受损的可能分子机制.[方法]DENV-1感染人脐静脉内皮细胞24 h后,分别提取对照组和病毒感染组的RNA样本进行测序,筛选差异表达的lncRNA,进行GO和KEGG富集分析,构建共表达网络图.[结果]共筛查到2623个显著差异表达的lncRNA,其中1441个为表达上调,1182个为表达下调.发现表达差异lncRNA及其预测靶基因主要富集于影响抗原提呈、干扰素合成、细胞凋亡、细胞粘附等生物过程.[结论]DENV-1感染HUVEC后,lncRNA表达谱发生明显变化,与登革出血热/登革休克综合征的发生发展密切相关.
关键词： Ⅰ型登革病毒 人脐静脉血管内皮细胞 长链非编码RNA -
CFTR对前脂肪细胞增殖和分化的影响
[目的]探讨囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)对内脏脂肪组织前脂肪细胞增殖和分化的调控作用.[方法]分别采用CFTR基因敲除小鼠(CFTR KO)4、8周龄及同周龄野生型对照鼠,分离内脏脂肪组织前脂肪细胞,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测增殖分化转录因子表达变化.采用地塞米松-异丁基甲基黄嘌呤-胰岛素(DMI)诱导3T3-L1细胞建立前脂肪细胞分化模型,采用免疫印迹(Western blot)技术检测CFTR及分化因子蛋白表达变化;并进一步转染CFTR沉默及过表达病毒,采用免疫印迹,实时荧光定量PCR技术,MTT检测和油红O染色,观察基因干预CFTR后对DMI诱导3T3-L1细胞增殖及分化的影响.采用高脂饮食肥胖小鼠模型,荧光定量PCR技术检测内脏前脂肪细胞增殖分化转录因子和CFTR基因水平表达.[结果]CFTR基因敲除鼠内脏前脂肪细胞指标Pref-1,增殖因子CyclinD1,分化转录因子PPARγ,C/EBPα表达明显降低(P<0.05).DMI诱导3T3-L1细胞分化早期,CFTR的表达增加(P<0.05);转染CFTR沉默病毒后,抑制DMI诱导的3T3-L1细胞增殖(C/EBPβ,C/EBPδ,CREB,KLF4)及末端分化指标(SREBP-1,PPARγ,C/EBPα)表达,而转染CFTR过表达病毒后,促进DMI诱导的3T3-L1细胞增殖及末端分化.高脂饮食喂养小鼠2,4周,高脂饮食组内脏前脂肪细胞增殖分化转录因子(PPARγ,C/EBPα,C/EBPβ,C/EBPδ,SREBP-1,FABP4)表达升高,CFTR基因表达升高(P<0.05).[结论]CFTR可能通过调控前脂肪细胞增殖及分化影响脂肪组织功能.
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三七花醇提物PNFM对健康人血小板功能的体外作用
[目的]探讨三七花醇提物(PNFM)对由二磷酸腺苷(ADP)诱导的健康志愿者血小板活化、释放、黏附、聚集等功能的影响及机制.[方法]用不同浓度(0、100、300和500μg/mL)的PNFM与健康人的血小板PRP孵育后,在血小板激活剂ADP诱导后,用CD62P及ATP释放以检测血小板颗粒物释放,比浊法检测聚集率,免疫荧光检测血小板在纤维蛋白原上的铺展,用Fluo 3-AM钙离子载体标记检测胞浆游离钙的变化.[结果]在激动剂ADP诱导下,500μg/mL的PNFM干预组血小板聚集率从对照组的(72.00±6.08)降到了35.67±3.78(P<0.01),300μg/mL干预组同样有抑制效果;与对照组相比(30.05±6.48),PNFM干预组明显降低健康人血小板表面CD62P,其中500μg/mL组降至(2.66±0.90,P<0.001);且均降低了PAC-1的表达,500μg/mL组(11.89±6.12)较对照组(33.37±8.12)差异显著(P<0.01);PNFM干预组均可抑制ATP释放,500μg/mL组由对照的1.93±0.47降至0.19±0.10(P<0.001);在血小板于纤维蛋白原上的铺展作用中,PNFM各剂量组也均显示有显著抑制作用,500μg/mL组由对照的89.57±17.34降至25.12±3.52(P<0.001);PNFM同样抑制血小板胞浆钙离子动员,其中500μg/mL组(71.25±5.33)较对照组差异显著(183.87±11.59,P<0.001);且均具有剂量依赖性.[结论]PNFM可在体外有效抑制健康人血小板活化、黏附及聚集等功能,为三七花通过调控血小板功能,从而防治心脑血管疾病提供了新的理论依据和临床应用基础.
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吡非尼酮药物缓释载体PTMAc-PEG-PTMAc水凝胶制备与体外实验
[目的]以PTMAc-PEG-PTMAc三嵌段(PPP)水凝胶为吡非尼酮(PFD)药物缓释载体,评价其药物缓释性能.观察PFD载药水凝胶对人眼Tenon′s囊成纤维细胞(HTF)增殖抑制作用.[方法]制备PPP水凝胶;研究其溶胀率及其影响因素;光学显微镜观察水凝胶(载药与空载)中人眼Tenon′s囊成纤维细胞(HTF)的形态学改变;直接接触法进行PPP载药水凝胶进行体外释药实验.通过测定浓度、计算累积药物释放量,绘制出两种水凝胶体外药物释放曲线.CCK-8法检测不同浓度不同时间点水凝胶材料对细胞活力的影响及载药水凝胶体外抑制HTF增殖.[结果]PPP水凝胶成胶稳定.扫描电镜显示水凝胶呈现三维立体网孔状结构.水凝胶具有溶胀特性.溶胀率随水凝胶材料浓度增加而减少.在体外释药试验显示在前4d有明显的药物突释,此后缓慢释药直至第14天达到平衡.增加载药浓度,减少凝胶体积将明显增加药物累积缓释量;显微镜观察PPP水凝胶有抑制HTF细胞黏附作用;PPP水凝胶与HTF相互作用24、48、72、96 h观察细胞活力分别为85.7％、93.0％、82.0％、81.6％,水凝胶不同方位HTF细胞形态不尽相同;水凝胶对细胞有抑制细胞黏附作用.两组不同载药浓度(1 mg/mL和2 mg/mL)载药水凝胶在24、48、72、96 h这4个时间点细胞增殖抑制率分别为25.8％、21.8％、55.4％、25.6％;44.6％、35.9％、55.5％、31.4％.而1 mg/mL PFD溶液在24、48、72、96 h这4个时间点细胞增殖抑制率分别为28.9％、29.7％,7.8％、7.7％.[结论]PPP水凝胶具备良好药物缓释性能,载吡非尼酮水凝胶能明显抑制HTF增殖且较含等量药物溶液长效.
关键词： 吡非尼酮 药物缓释 三嵌段共聚物 水凝胶 眼Tenon′s囊成纤维细胞 -
重组蛋白PTD-HSP27进入细胞保护视网膜神经节细胞抗氧化损伤
[目的]观察重组蛋白PTD-HSP27穿透视网膜视神经节细胞RGC-5的能力及其效率,测定重组蛋白PTD-HSP27对氯化钴(CoCl2)诱导的视网膜神经节细胞(RGC-5)细胞损伤的保护作用并初步探讨其机制.[方法]用FITC标记重组蛋白PTD-HSP27,荧光显微镜观察PTD-HSP27-FITC的穿透细胞膜的能力,用紫外分光光度计检测PTD-HSP27-FITC的穿膜效率,随后建立RGC-5细胞损伤模型.实验分为正常对照组、CoCl2损伤组、PTD-HSP27+CoCl2处理组,分别进行相应处理后,通过Annexin V-FITC/PI双染法检测各组细胞凋亡比例;Western Blotting检测各组细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3等凋亡相关蛋白的表达水平.[结果]荧光显微镜下观察到重组蛋白PTD-HSP27-FITC能够有效通过细胞膜进入RGC-5细胞内,其进入细胞的效率为(47.29±2.33)％.CoCl2浓度依赖性地抑制RGC-5细胞存活率.比较正常对照组、CoCl2损伤组和PTD-HSP27+CoCl2处理组的检测结果示:PTD-HSP27能有效抑制CoCl2诱导的RGC-5细胞早期凋亡(P<0.01);PTD-HSP27能有效提高Bcl-2/Bax的表达比例,并抑制Caspase-3的激活(P<0.01).[结论]重组蛋白PTD-HSP27能有效地穿过细胞膜进入RGC-5细胞内,且对CoCl2诱导的RGC-5细胞氧化应激损伤有保护作用,机制可能是通过调控Bcl-2/Bax的蛋白比例抑制细胞的早期凋亡.
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去分化联合IDO基因修饰增强人脐带间充质干细胞的抗氧化应激存活及Treg细胞诱导能力
[目的]研究去分化处理联合吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)基因修饰,对人脐带间充质干细胞(hMSC)抗氧化应激生存能力及诱导调节性T淋巴细胞(Treg)能力的影响.[方法]通过对hMSC的短暂成脂分化诱导和恢复培养,获得去分化hMSC(De-hMSC).实验组De-hMSC感染携带IDO基因的重组逆转录病毒,对照组为感染绿色荧光蛋白(ZsGreen1)基因的De-hMSC以及正常培养的未感染De-hMSC和hMSC.通过Western blot检测被感染细胞的IDO蛋白表达,应用流式细胞术测定IDO基因修饰型De-hMSC(IDO/De-hMSC)的免疫表型,同时鉴定其成骨和成脂分化能力.利用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术比较各组细胞在300μmol/L t-BHP作用下的抗氧化应激生存能力,采用三色荧光标记流式细胞术测定含各组细胞培养上清的条件培养基对正常人外周血单个核细胞(PBMC)中Treg细胞含量的影响.[结果]IDO/De-hMSC仍具有间充质干细胞的免疫表型和成骨、成脂分化能力.在300μmol/L t-BHP作用下,De-hMSC的细胞存活率较hMSC明显增加(P<0.05),经IDO基因修饰后De-hMSC的细胞存活优势无明显改变(P>0.05).与未修饰的各对照组相比,含IDO/De-hMSC上清的条件培养基能明显上调PBMC中CD4+CD25+CD127low Treg细胞的含量(P<0.05).[结论]成脂去分化联合IDO基因修饰不影响hMSC的干细胞特性,并能同时增强hMSC的抗氧化应激生存能力及其对Treg细胞的诱导能力,是一种有望在免疫抑制治疗中发挥作用的间充质干细胞修饰策略.
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卡博替尼联合PD-L1单抗对黑色素瘤小鼠移植瘤的抑制作用机制
[目的]探讨卡博替尼联合PD-L1单抗对恶性黑色素瘤小鼠皮下移植瘤生长的影响及作用机制.[方法]利用体外培养的小鼠黑色素瘤细胞B16-F10建立小鼠皮下移植瘤模型,成瘤后将小鼠随机分为盐水对照组、溶剂对照组、PD-L1单抗组、卡博替尼组和卡博替尼联合PD-L1单抗组(联合组).观察肿瘤生长情况及每2 d测量一次肿瘤体积.肿瘤体积达到2000 mm3或是组间差距有显著统计学差异时定义为研究终点.达到研究终点后处死小鼠取材,流式细胞学检测肿瘤组织中浸润免疫细胞情况,包括CD4+、CD8+T淋巴细胞及髓源性抑制细胞(MDSC).另将体外培养的B16-F10细胞分别经不同药物处理后,行流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot检测AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白表达水平.[结果]B16-F10黑色素瘤移植瘤模型显示,PD-L1单抗组没有明显抑瘤作用,卡博替尼组与联合组均有明显抑瘤效应,联合组抑瘤效果较卡博替尼组更为显著,差异具有统计学意义(P=0.0015).在体外实验中,药物处理24及48 h后流式细胞术检测B16-F10细胞凋亡,结果显示联合组与卡博替尼组相比,B16-F10细胞凋亡比例均显著增高,差异具有统计学意义(24 h:P=0.0035;48 h:P=0.0029).Western blot检测显示联合组及卡博替尼组对AKT和mTOR蛋白水平无明显影响,但均可下调p-AKT和p-mTOR蛋白水平,联合组作用更为显著.[结论]卡博替尼联合PD-L1单抗有协同抗肿瘤作用,这种协同抗肿瘤作用机制可能是通过促进B16-F10细胞凋亡及抑制AKT/mTOR通路所致.
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间充质干细胞对B细胞增殖及免疫调节功能的影响
[目的]研究观察间充质干细胞(MSC)在体外培养体系对B细胞增殖和免疫调节作用的影响.[方法]采用密度梯度离心法分离健康捐献者来源的骨髓30 mL.用含100 mmol/L胎牛血清的L-DMEM培养基对分离出的MSC进行贴壁培养.培养至第6代时,进行多向分化和细胞表型鉴定.获取健康供者外周血单个核细胞,并通过流式细胞仪分选出CD19+B细胞,进行荧光染料CFSE标记,然后分成单独培养组(CD19+B细胞)和共培养组(按CD19+B:MSC:=5:1的比例共培养),两组均采用CpG+CD40L刺激,96 h后检测B细胞的增殖情况,并通过流式细胞荧光分选技术(FACS)检测CD19+CD5+B细胞的百分比及其分泌的IL-10水平;进一步观察单独培养组和共培养组的CD19+B细胞对CD4+T细胞增殖以及分泌IFN-γ的影响,后加入IL-10中和抗体,再次验证B细胞对CD4+T细胞增殖以及分泌IFN-γ的影响.[结果]健康捐献者来源的MSC具有多向分化能力,并表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166,不表达CD45和CD34.与单独培养组比较,共培养组中的CD19+B细胞与MSC在体外共培养3 d后,CD19+B细胞增殖比例明显提高,并显著抑制CD4+T细胞分泌IFN-γ的功能.进一步分析CD19+B细胞的亚群,发现与单独培养组比较,共培养组中的CD5+B细胞数量的百分比由(21.31±1.22)％增加至(31.27±0.92)％(P=0.014);而且其IL-10的分泌水平由(1.09±0.08)％增加至(2.44±0.06)％(P<0.001).当在共培养组中加入IL-10中和抗体后,发现与MSC共培养的B细胞抑制CD4+T细胞增殖和分泌IFN-γ的功能的能力明显减弱.[结论]MSC能促进CD19+B细胞的增殖,同时具有增强CD19+B细胞抑制CD4+T细胞分泌IFN-γ,这可能与分泌IL-10的CD19+CD5+B细胞的表达增加相关.
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过氧化物还原酶3参与肾透明细胞癌发生与发展的分子机制
[目的]探讨肾透明细胞癌组织中硫氧还蛋白依赖的过氧化物还原酶3(PRDX3)的表达与肾透明细胞癌发生发展的关系.[方法]本研究首先在16例肾透明细胞癌组织及癌旁组织中验证了PRDX3的表达.根据表达量构建了786-O的PRDX3过表达细胞系及敲低表达细胞系,考察了PRDX3过表达和敲低表达后,肿瘤细胞的生长情况.通过pull-down试验联合LC-MS/MS技术寻找PRDX3的相互作用蛋白.初步探究了PRDX3与过氧化物酶1(PRDX1)的相互作用关系及PRDX3参与肾透明细胞癌发生发展的机制.[结果]16例肾透明细胞癌组织样本的western blot检测结果表明,有14例样本PRDX3下调表达,下调均值1.78倍左右.成功筛选到PRDX3过表达的786-O单克隆细胞系和对照细胞系[786O-PRDX3(+)和786O-PRDX3(-)]和PRDX3敲低表达的786-O单克隆细胞系和无意义序列对照细胞系(786O-PRDX3 KN和786O-PRDX3 NCi).qPCR和western blot结果表明,相比786O-PRDX3(-)组,786O-PRDX3(+)组在mRNA水平过表达约2.1倍,在蛋白水平过表达约1.8倍;相比786O-PRDX3 NCi组,786O-PRDX3 KN组在mRNA水平低表达约0.48倍,在蛋白水平低表达约0.51倍.CCK-8试验表明,相比786O-PRDX3(-),786O-PRDX3(+)细胞生长速率明显降低.但敲低PRDX3的表达后,敲低组和其对照组细胞的生长速率却无显著性差异.Pull-down试验发现PRDX3可能与PRDX1存在相互作用.结合质谱分析及数据库检索,发现PRDX3通过二硫键与PRDX1结合并发挥作用,分别通过plink软件鉴定到二者可信的结合位点,初步探讨了PRDX3参与肾透明细胞癌发生发展的可能机制.[结论]PRDX3在肾透明细胞癌组织中下调表达,可能参与了肿瘤的发生发展.提高PRDX3的表达水平,能显著降低肿瘤细胞的生长速率.基于PRDX3蛋白,可能开发针对肾透明细胞癌的靶向药物.
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顺铂耳毒性小鼠模型的建立
[目的]建立一种可靠的、重复性好的顺铂耳毒性小鼠模型,为进一步从分子学和基因方面研究顺铂的耳毒性机制提供可能.[方法]20只听力正常的健康小鼠,随机平分为2组,A组小鼠先行200 mg/kg呋塞米腹腔注射,1 h后腹腔注射1.0 mg/kg顺铂;B组小鼠先行200 mg/kg呋塞米腹腔注射,1 h后腹腔注射0.5 mg/kg顺铂.6只同年龄小鼠做正常对照组.治疗后第10天所有小鼠行听觉脑干电反应(ABR)测听和畸变产物耳声发射(DPOAE)检查,之后取双侧耳蜗,分别行全耳蜗基底膜铺片和环氧树脂包埋半薄切片,观察内外毛细胞、血管纹和螺旋神经节细胞等的病变.[结果]2组小鼠治疗后各频率ABR平均听阈都提高,DPOAE值都降低,其中A组的ABR平均听阈显著提高,各频率振幅明显降低,高频区DPOAE消失;B组的ABR平均听阈稍提高,高频(16、20、32 kHz)振幅轻度降低,低频(4、8、12 kHz)振幅无变化,高频DPOAE稍下降,低频DPOAE无变化.全耳蜗基底膜铺片结果A组蜗底外毛细胞全部破坏,蜗尖大部分外毛细胞破坏;B组仅蜗底外毛细胞大部分被破坏,蜗尖外毛细胞形态和数目接近正常,两组内毛细胞均无明显减少.半薄切片结果显示A、B两组小鼠的耳蜗血管纹和螺旋神经节细胞的形态和数目都接近正常.[结论]1.0 mg/kg顺铂联合200 mg/kg呋塞米单次腹腔注射法可引起小鼠内耳组织显著损伤,主要表现为耳蜗外毛细胞损失.
