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含人 LINGO -1慢病毒干扰载体的构建与鉴定
目的：体外构建含人 LINGO -1慢病毒干扰载体，并测定其对靶基因 LINGO -1的干扰效应。方法2015年3—11月，根据 GenBank 数据库中报道的人 LINGO -1基因序列，设计合成针对人 LINGO -1短发夹 RNA （LINGO -1 shRNA）干扰序列，并将其克隆至重组质粒载体，测序验证后在293T 细胞内包装慢病毒并测定病毒滴度。将慢病毒载体分为目标基因干扰载体组（实验组）和错配序列干扰载体组（对照组），并转染至人胶质细胞瘤细胞U251，荧光显微镜下观察其感染效率，并采用免疫荧光染色、实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）法检测 LINGO-1 mRNA 表达水平，采用 Western blotting 法检测 LINGO -1 表达水平。结果成功构建两组慢病毒干扰载体，经过包装分别得到滴度为2×108 TU/ ml 和4×108 TU/ ml 的病毒原液。病毒载体感染人胶质细胞瘤细胞 U251后，实验组和对照组载体转染效率分别为96.6％、95.2％。免疫荧光染色显示，人胶质细胞瘤细胞 U251高表达 LINGO -1，经慢病毒载体转染后，实验组免疫荧光呈现减弱现象。实验组 LINGO -1 mRNA 表达水平（0.09±0.01）较对照组的（1.00±0.00）降低（t ＝12.87，P ﹤0.01），实验组 LINGO -1 mRNA 相对表达抑制率为91.0％。实验组 LINGO -1 表达水平（0.28±0.02）较对照组的（1.00±0.00）降低（t ＝-8.13，P ﹤0.01）。结论本研究成功构建了含人 LINGO -1 shRNA 干扰载体，并证实了干扰载体对靶基因有较好的干扰效果，为研究 LINGO -1 在轴突再生中的作用奠定了基础。
