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新的囊胚活检方法——囊胚活检不再纠结和繁琐
囊胚活检目前是进行胚胎植入前遗传学诊断/筛查(PGD/PGS)以及单基因疾病诊断的前提.目前常规使用的提前打孔的囊胚活检方法,会出现囊胚孵出时间不确定、内细胞团处于孵出部位以及囊胚过早孵出等异常现象,给囊胚活检带来了一定的困难,并部分地影响到囊胚终移植的临床结局.新的非提前打孔囊胚活检法,利用透明带本身的束缚作用减少激光的创面,可以大程度地减少活检时异常情况的出现,使得活检更加简单并且可控,可以在一定程度上改善移植胚胎的临床结局.
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昆明小鼠胚胎干细胞囊胚孵出前不同培养方法的效果比较
目的:胚胎干细胞的获得、克隆与传代对实验条件及操作技术水平要求较高.分别将单纯胚胎干细胞培养液法与KSOM-胚胎干细胞培养液法应用于昆明小鼠胚胎干细胞囊胚孵出前阶段,对体外培养的胚胎干细胞进行鉴定,并比较其增殖与克隆形成情况.方法:实验于2006-03/10在哈尔滨医科大学组织胚胎学教研室暨组织工程中心完成.①冲胚液配制:含体积分数为0.05胎牛血清的磷酸盐缓冲液,4℃冰箱保存.②KSOM胚培养液配制:将配制好的贮存液放入-20℃冰箱保存,用时加入1 g/L的胎牛血清白蛋白和1 mL/L的丙酮酸钠,过滤,调配至100 mL.③取6～8周龄雌性昆明小鼠35只腹腔内注射孕马血清绒毛膜促性腺激素7.5 IU/只,48 h后注射人绒毛膜促性腺激素7.5 IU/只,然后与10周龄雄性昆明小鼠15只合笼,次日晨雌鼠见栓者记为妊娠0.5 d.④于妊娠3.5 d冲胚,将冲出的囊胚分别应用于单纯胚胎干细胞培养系统、KSOM-胚胎干细胞培养系统.前者直接利用胚胎干细胞培养液在饲养层上培养并孵出囊胚;后者先应用KSOM液滴培养囊胚至孵出,再改用胚胎干细胞培养液于饲养层上培养孵出的囊胚.⑤将孵出的囊胚置于预先制备好的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养,酶-机械法分离囊胚内细胞团,观察可传代的囊胚内细胞团数与原代胚胎干细胞的克隆形成率.⑥对培养的胚胎干细胞进行Oct-4染色和碱性磷酸酶染色鉴定,并检测其体外分化能力.结果:①不同培养系统对孵出囊胚状态的影响:KSOM-胚胎干细胞培养系统:KSOM液滴中处于囊胚内细胞团状态的囊胚腔逐渐增大,待取出时胚胎扩展更加充分,一侧突出一个大泡但未突破透明带,此为正在孵出的囊胚.孵出后仍维持有腔的囊胚状态,表明胚胎的质量良好.移入饲养层后即贴壁,囊胚内细胞团开始增殖.单纯胚胎干细胞培养系统:囊胚培养24 h后开始孵出并贴壁,囊胚内细胞团逐渐增大,后将囊胚腔充满.②不同培养系统对原代胚胎干细胞克隆形成率的影响:KSOM-胚胎干细胞培养系统、单纯胚胎干细胞培养系统的囊胚总数分别为154只和131只,差异无显著性意义(P＞0.05);两种培养系统的囊胚内细胞团可传代数量分别为89只和80只,增殖到能够离散的程度基本相似(57.8%,20.1%,P＞0.05);原代胚胎干细胞囊胚内细胞团离散后出现集落数分别为31个和38个,克隆形成率差异无显著性意义(20.1%,29.0%,P＞0.05).③胚胎干细胞鉴定结果:第5代胚胎干细胞Oct-4染色和碱性磷酸酶染色均呈阳性.④胚胎干细胞体外分化能力检测结果:胚胎干细胞团块悬浮培养4 d时,形成由上百个细胞组成的球状拟胚体.结论:①单纯胚胎干细胞培养液一步法与KSOM-胚胎干细胞培养液两步法孵出囊胚所获得的胚胎干细胞集落形态类似,均具有胚胎干细胞的形态学特征,但后者在KSOM液培养阶段有利于囊胚孵出前的早期胚胎发育同步化.②两种培养方法得到的胚胎干细胞其增殖及克隆形成能力基本相似.
