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人肺癌A549细胞气-液界面暴露汽油发动机尾气中NO2的基准剂量评估
目的 通过气-液界面技术将人肺癌A549细胞暴露于不同工况下汽油发动机尾气,探讨汽油发动机尾气中的NO2浓度与A549细胞存活率的剂量-效应关系及其基准剂量,为汽车尾气中NO2的毒性效应风险评估提供基础数据.方法 用气袋分别收集在怠速(冷启动)、53％和100％负荷下产生的汽油发动机尾气.采用盐酸萘乙二胺分光光度法检测汽油发动机尾气中NO2的浓度;应用气-液界面技术将人肺癌A549细胞暴露于汽油发动机尾气,使用噻唑蓝比色法试剂盒检测A549细胞的相对存活率.洁净空气暴露组设为对照组,根据汽油发动机尾气中的NO2浓度分为3个剂量组,进行剂量-效应关系分析.使用美国环境保护总署(EPA)的基准剂量工具软件(Benchmark Dose software,BMDS)中的Hill、Linear、Polynomial和Power 4种模型,根据模型拟合的AIC系数(Akaike Information Coefficient)和P值确定模型的拟合效果来计算汽油发动机尾气中NO2的毒作用基准剂量和基准剂量下限值.结果 洁净空气暴露组的NO2浓度为0 mg/m3,A549细胞的相对存活率为90.58％±5.11％.在怠速(冷启动)、100％和53％负荷下,汽油发动机尾气中NO2的平均浓度分别为6.6、8.2和9.2 mg/m3,A549细胞的相对存活率分别为74.27％±4.05％、63.86％±2.58％和58.77％ +0.81％.Hill、Linear、Polynomial和Power 4种模型显示,随着汽油发动机尾气中NO2浓度的升高,A549细胞的相对存活率随之降低.以拟合效果好的Power模型估算得到的不同工况下汽油发动机尾气中NO2的毒作用基准剂量和基准剂量下限值分别为2.83和1.96 mg/m3.结论 不同工况下汽油发动机尾气中的NO2可对A549细胞的相对存活率产生影响,引起细胞存活率下降,并有剂量-效应关系.气-液界面暴露于汽油发动机尾气NO2的A549细胞存活率明显降低的参考剂量为1.96 mg/m3.
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气-液界面暴露汽车尾气致BEAS-2B细胞的毒性效应
目的 应用新型的气-液界面细胞染毒手段,探讨汽车尾气对人肺细胞毒性效应的影响程度,以及采用0.2 μm滤器过滤尾气干预后的细胞毒性变化情况.方法 用20 L Tedlar气袋收集汽车尾气,并通过粒径谱仪分析0.2μm滤器过滤前后的汽车尾气颗粒物数量、表面积和质量浓度.实验分为空白对照组、洁净空气组、汽车尾气过滤组和汽车尾气组.空白对照组未作任何处理;洁净空气组为21％ 02和79％N2;汽车尾气过滤组为用0.2 μm颗粒物过滤器过滤后的汽车尾气;汽车尾气组为用气袋直接收集的汽车尾气.除了空白对照组,其余3组利用气-液界面体外染毒技术,在染毒流量为25 mL/min,37℃水浴条件下,对生长在气-液界面插件多孔膜上的BEAS-2B细胞持续染毒60 min.利用CCK-8(cell counting Kit-8)检测法评价细胞的存活率.采用2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(2',7'-dichloro-dihydro-fluoresceindiacetate,DCFH-DA)探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平.Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测汽车尾气对BEAS-2B细胞凋亡及坏死率的影响.结果 汽车尾气组中0.5 ～10 μm颗粒物数量浓度、表面积浓度和质量浓度分别为0.24×103个/cm3、0.29×103 μm2/cm3和0.19 μg/m3,10 ～ 500 nm颗粒物数量浓度、表面积浓度和质量浓度分别为56×103个/cm3、34.53×108nm2/cm3和95 ng/m3.汽车尾气过滤组0.5 ～ 10 μm颗粒物数量浓度、表面积浓度和质量浓度分别低于1个/cm3、1 μm2/cm3和0.001 μg/m3,10～ 500 nm颗粒物数量浓度、表面积浓度和质量浓度与汽车尾气组相比分别降低了89.79％、93.57％和90.55％.洁净空气组的细胞存活率、胞内ROS、早期凋亡率和晚期凋亡坏死率分别为(90.15±4.25)％、(1.92±0.34)×105、(1.09±0.48)％、(8.93±3.31)％.与洁净空气组比较,两组汽车尾气组的细胞存活率、胞内ROS和晚期凋亡及坏死率差异均有统计学意义(P＜0.05).汽车尾气过滤组与汽车尾气组之间的比较发现,汽车尾气组细胞存活率[(58.09±4.06)％]低于汽车尾气过滤组[(66.85±3.49)％],差异有统计学意义(t=6.331,P＜0.001),胞内ROS[汽车尾气过滤组:汽车尾气组=(2.94±0.21) ×105:(3.32±0.49)×105,t=-1.252,P=0.279]、早期凋亡率[汽车尾气过滤组:汽车尾气组=(1.09±0.30)％:(0.99±0.10)％,t=0.708,P=0.497]和晚期凋亡坏死率[汽车尾气过滤组:汽车尾气组=(21.75±10.37)％:(15.32±2.74)％,t=1.347,P=0.242]差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 人肺细胞气-液界面暴露于汽车尾气可产生显著的毒性效应,0.2 μm过滤器过滤尾气干预后,细胞毒性会明显降低.
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不同粒径谱汽油发动机尾气气-液界面染毒对BEAS-2B细胞存活率的影响
目的 采用气-液界面(ALI)体外细胞染毒技术,评价不同粒径谱汽油发动机尾气(GEE)对人肺BEAS-2B细胞存活率的影响.方法 用Tedlar集气袋收集GEE,并通过TSI-3321和SMPS-3938两种粒径谱仪分析过滤后的汽车尾气组、汽车尾气组和非三元催化配置的摩托车尾气组的颗粒物个数、表面积和质量浓度,同时设置空白对照组和洁净空气组.除了空白对照组,其余4组采用ALI体外细胞染毒技术,在染毒流量为25 ml/min,37℃水浴条件下,对生长在Transwell插件多孔膜上的BEAS-2B细胞持续染毒60 min.通过CCK-8细胞毒性检测试剂盒测定细胞的相对存活率.结果 过滤后的汽车尾气组、汽车尾气组和摩托车尾气组均可检出较高浓度的细颗粒物,但粗颗粒物很少,且呈摩托车尾气组>汽车尾气组>过滤后的汽车尾气组的趋势(P<0.001).与洁净空气组比较,过滤后的汽车尾气组、汽车尾气组和摩托车尾气组的细胞相对存活率均明显降低,差异有统计学意义(P<0.001).各GEE暴露组之间的比较显示,细胞相对存活率呈过滤后的汽车尾气组>汽车尾气组>摩托车尾气组的趋势(P<0.001);以洁净空气组为参考,过滤后的汽车尾气组、 汽车尾气组、 非三元催化配置的摩托车尾气组的细胞相对存活率均数依次降低了26.34%、36.00%和49.59%.结论 人肺BEAS-2B细胞ALI暴露于不同粒径谱的GEE可产生不同程度的毒性作用,降低GEE颗粒物浓度以及配置三元催化装置可明显改善肺细胞的存活率.
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体外诱导骨髓间充质干细胞向上皮样细胞分化
目的 通过体外气-液界面共培养的方法,诱导兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)向上皮样细胞分化.方法 贴壁分离法体外培养BMSCs,pMSCV/GFP逆转录病毒转染BMSCs,使BMSCs成功表达绿色荧光蛋白.同时两步酶消化法(Pronase酶和胰酶)体外培养兔气管上皮细胞(RTEs),Cytokeratin18(CK-18)单克隆抗体鉴定.建立气-液界面培养模型,将标记有GFP的BMSCs和RTEs以一定比例混匀接种到套皿内,连续共培养14d,CK-18免疫荧光染色鉴定分化结果.结果 荧光显微镜下,pMSCV/GFP逆转录病毒转染BMSCs呈现明显的绿色荧光,同时共培养后部分标记有GFP的BMSCs经CK-18荧光染色,呈现红色荧光,说明经GFP标记的BMSCs已被成功诱导分化成气管上皮.结论 体外气-液界面条件下,兔BMSCs与原代培养兔RTEs共培养可以成功诱导分化为上皮样细胞,表达上皮特异性角蛋白CK-18,为BMSCs作为组织工程化气管的种子细胞奠定实验基础.
