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荧光共振能量转移技术阳性参照质粒的构建及应用
目的 构建青色荧光蛋白(CFP)基因和黄色荧光蛋白(YFP)基因相连接的真核表达载体pYFP-CFP,并检测融合蛋白CFP-YFP的FRET转移效率,为FRET技术提供阳性参照物. 方法 利用基因重组法,以带有CFP基因序列的质粒(pCFP)为模板,扩增CFP基因并插入黄色荧光蛋白载体(pYFP)的多克隆位点中,构建真核表达质粒pYFP-CFP.经细胞转染后,使其表达CFP和YFP相连的融合蛋白.在激光共聚焦显微镜下采集FRET信号图和FRET转移效率(EFRET)的计算,并比较和分析表达CFP-YFP的阳性细胞与CFP和YFP共表达的阴性细胞. 结果 真核表达质粒pYFP-CFP构建成功,并在细胞质中表达,这与pCFP和pYFP共转染的细胞中荧光蛋白的分布略有不同,后者在细胞胞质和细胞核中均有表达.统计结果显示表达融合蛋白的阳性组EFRET明显高于共表达的阴性组,差异有统计学意义. 结论 融合荧光蛋白分子的青色和黄色蛋白之间具有10个氨基酸残基相连,符合FRET现象发生的条件,能够采集到很强的FRET信号,可作为FRET研究的稳定阳性实验参照.
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DC-SIGN荧光融合蛋白的构建、表达和生物学功能初探
目的构建绿色荧光蛋白(EGFP)标记的DC-SIGN分子(DC-SIGN-EGFP融合蛋白),并在哺乳动物细胞中获得功能性表达.方法 PCR方法获得DC-SIGN分子和EGFP分子的cDNA,分别克隆入真核表达载体pEGFP-N1和真核表达载体pCI, 使EGFP荧光蛋白分别位于DC-SIGN蛋白的C末端和N末端.在转染COS-7细胞后,在激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测重组分子的表达及融合蛋白在细胞定位情况.激光共聚焦显微镜检测融合蛋白的功能情况.结果获得了预期的重组表达质粒, 经DNA测序证实开放阅读框正确,转染COS-7细胞后绿色荧光蛋白位于细胞膜,仅EGFP位于DC-SIGN N-末端的融合蛋白可被抗DC-SIGN抗体结合. EGFP位于DC-SIGN N-末端的融合蛋白可有效摄取DC-SIGN受体的高亲和力配体le(x)寡糖.结论所构建的DC-SIGN-EGFP融合蛋白在细胞内表达后具有细胞表面受体分子的特征性分布,可被抗DC-SIGN抗体检测及摄取特异性配体,为进一步深入研究DC-SIGN分子功能提供了良好的模型.
关键词： C-型凝集素DC-SIGN 荧光融合蛋白 重组表达 Le(x)寡糖
