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pSilencer 3.1-Sirt3基因RNA干扰表达载体的构建及鉴定
目的 构建Sirt3基因的RNA干扰载体,并在真核细胞中进行pSilencer 3.1-Sirt3的功能鉴定. 方法 利用体外DNA合成技术及液相色谱纯化技术合成Sirt3干扰序列,通过酶切将干扰序列连接至pSilencer 3.1载体中,将阳性克隆载体转入感受态大肠杆菌细胞后,筛选阳性克隆,通过第二代体外DNA测序技术进行序列测定.将测序正确的克隆用于Westernblot实验和real time PCR实验,以对其在真核细胞中的正确表达和内源性Sirt3的干涉效果进行鉴定. 结果 PCR扩增得到序列测定结果与干扰序列完全一致.构建的pSilencer 3.1-Sirt3质粒在AGS和SGC-7901细胞中进行基因的转染,pSilencer3.1-Sirt3能够有效抑制内源性Sirt3的mRNA水平和蛋白质水平的表达. 结论 成功构建获得Sirt3干扰载体,并有效降低Sirt3的mRNA和蛋白质水平的表达,为今后Sirt3的功能研究提供良好的基础.
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亚低温对大鼠自发性蛛网膜下腔出血急性期脑组织线粒体功能的影响
目的 观察亚低温对大鼠自发性蛛网膜下腔出血(SAM)急性期脑组织线粒体活性氧(ROS)生成及能量代谢的影响,并探讨亚低温作用的相关信号通路. 方法 SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、SAH常温组和SAH亚低温组(每组各6只),后两组采用视交叉前池注血法建立SAH模型,SAH亚低温组在脑池注血后即刻给予亚低温干预(32.5～33.5℃).各组大鼠于SAH后2h处死取材,电镜下观察海马CA1区超微结构,比色法检测线粒体锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量,极谱法检测线粒体呼吸速率,二氯荧光素法检测线粒体ROS生成速率,JC-1荧光标记法检测膜电位,荧光素酶发光法检测线粒体ATP合成活力,实时荧光定量PCR法检测脑组织Sirtuin-3 (SIRT3) mRNA表达,Westernblotting法检测线粒体SIRT3蛋白表达. 结果 与SAH常温组比较,SAH亚低温组SIRT3mRNA和蛋白表达、线粒体ATP合成活力和膜电位,线粒体态3呼吸速率[(55.26±6.30) nmolO2/min· mg蛋白]、呼吸控制比(5.15％±0.63％)、磷氧比(2.16％±0.25％),MnSOD、GPx、CAT活性均明显上调,差异均有统计学意义(P＜0.05); SAH亚低温组线粒体态4呼吸速率[(10.67±1.69) nmolO2/min· mg蛋白]、ROS产生速率及MDA含量明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 亚低温可提高线粒体能量代谢效率及ROS清除能力,增强脑组织对SAH的耐受力.
