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重组人肝细胞生长因子重链(rhHGF-α)蛋白的表达与纯化
大肠杆菌中表达的rhHGF-α以包涵体形式存在，表达量约占菌体总蛋白的25％。为了建立一条简便的分离纯化生产工艺，我们研究了包涵体溶解及复性条件，并进行了活性测定。结果表明，用含有4 mol/L尿素的缓冲液洗涤包涵体，8 mol/L尿素溶解包涵体后的上清，经过SephacrylS-200凝胶过滤、复性后，得到纯度达90％的rhHGF-a，SDS-PAGE测定相对分子质量为52 000。与rhHGF-β体外共复性后，完整的rhHGF具有明显刺激原代培养大鼠肝细胞生长的活性。
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小泛素样修饰蛋白-1对α-突触核蛋白基因突变或过表达诱导的细胞包涵体形成及细胞凋亡的影响
目的 探讨α-突触核蛋白(α-synuclein)的小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)-1对α-synuclein基因过表达或突变诱导的细胞包涵体形成及细胞凋亡的影响.方法 构建野生型(WT)、A53T突变型和缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型、K96R-A53T突变型α-synuclein真核表达质粒.应用脂质体介导转染方式将构建好的质粒转入HEK293细胞；48 h后Hoechst 33258染色,采用Axiovert200型倒置荧光显微镜观察对细胞的影响,应用四甲基偶氮唑盐检测细胞活力,Annexin V-PE流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 将构建所得真核表达质粒经双酶切鉴定及DNA测序证实；将WT型、A53T型、K96R型、K96R-A53T型α-synuclein真核表达质粒转染HEK293细胞,48 h后伊红染色显示转染野生型α-synuclein- pEGFP组及A53T突变型组某些细胞胞浆内出现圆形的嗜酸性小体(类Lewy小体)形成,分别占细胞总数的9.4％和11.7％,转染K96R及K96R-A53T融合表达载体组细胞内嗜酸性小体形成比率为10.2％和9.8％,两两相比差异无统计学意义(P＞0.05).Hoechst染色结果显示,WT组、A53T组细胞核变大,出现着色不均,染色质聚集成斑点状,未见核浓缩或核碎裂.K96R组及K96R-A53T组胞核着色基本均匀.采用四甲基偶氮唑盐法结果显示转染空质粒组细胞活力为96.2％,转染WT组、A53T组细胞活力下降至53.4％及56.1％,转染K96R组及K96R-A53T组细胞活力为72.3％和69.8％；转染48 h后,WT组、A53T组细胞凋亡率分别为32.2％和34.1％,转染K96R组及K96R-A53T突变组细胞凋亡率下降为19.4％和20.3％,两两相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 SUMO-1对α-synuclein基因过度表达及α-synuclein基因致病突变A53T诱导的细胞包涵体的形成无明显影响；SUMO-1可加强α-synuclein基因过度表达及α-synuclein基因致病突变A53T诱导的细胞毒性及细胞凋亡,提示SUMO-1参与了细胞凋亡过程.
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pPRMETb-TRAIL原核表达载体的构建和表达及纯化
目的:为获取较高纯度的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)工程蛋白.方法:将TRAIL基因构建于原核表达载体pPRMETb中,在大肠杆菌中由异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对包涵体进行洗涤、尿素裂解、复性后过镍柱层析纯化.结果:经酶切、测序鉴定证实pPRMETb-TRAIL构建完全正确,在大肠杆菌xll-blue中经IPTG诱导表达量较高,包涵体经尿素裂解后行镍柱纯化得到了较高纯度的TRAIL蛋白.结论:成功地建立了获取高纯度TRAIL工程蛋白的技术路线.
关键词： 大肠杆菌 细胞包涵体 聚合酶链反应 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体
