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恙虫病东方体蛋白基因的原核表达及活性鉴定
目的对恙虫病东方体Gilliam株56kDa外膜蛋白基因进行原核表达,并对表达产物进行纯化,以获得有生物活性的重组蛋白,用于恙虫病诊断试剂的研制.方法根据Gilliam株东方体56kDa蛋白基因序列设计特定引物,用PCR法扩增出编码56kDa抗原长约1 320 bp的DNA,克隆至原核载体PET28a,构建了表达载体PET-OTG,并获表达.表达产物经镍(Ni2+)柱亲和层析纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白印迹(Western-blot)分析鉴定,并用间接ELISA进行抗原性分析.结果SDS-PAGE检测表明重组蛋白分别以可溶性蛋白和包涵体两种方式表达,在相对分子质量约52 kDa处有表达目的条带.经Ni2+层析柱纯化得到目的蛋白,包涵体蛋白纯化后纯度大于可溶性蛋白,达电泳纯.Western-blot证实该蛋白能被患者阳性血清所识别,用阴性血清则未出现相应印迹.间接ELISA结果表明重组蛋白具有良好的抗原性,能有效区分恙虫病阳性和阴性血清.结论重组蛋白具有免疫反应活性,有望作为诊断抗原用于恙虫病的诊断.
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恙虫病东方体Gilliam株56kDa蛋白部分基因的原核表达及初步鉴定
目的对恙虫病东方体Gilliam株56kDa蛋白部分基因进行原核表达,以获得高效表达、有生物活性目的蛋白,为恙虫病诊断试剂的研制打下基础.方法根据Gilliam株东方体56kDa蛋白基因序列设计特定引物,用PCR法扩增出编码56kDa抗原富含亲水区及同源性高的C端一段长约700bp的DNA,插入原核载体PGEX-4T-2,转化大肠杆菌TGI,抽提质粒,酶切鉴定,含插入片段的重组质粒进行序列分析,再转化表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western-blot进行分析鉴定.结果SDS-PAGE检测表明该截短片段以融合蛋白的方式得到成功表达,在相对分子量58kDa处有表达条带,经薄层扫描分析,目的蛋白条带占全菌蛋白的30.5%.Western-blot证实该融合蛋白能被恙虫病患者阳性血清识别.结论表达产物初步鉴定具有生物活性,有望应用于恙虫病诊断试剂的研制.
