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人乳头瘤病毒重组质粒的构建及蛋白表达
目的构建重组原核表达质粒获得人乳头瘤病毒18型L1片段(HPV18L1)活性蛋白,为进一步研制人乳头瘤病毒18型(HPV18)基因工程疫苗打下基础.方法以重组质粒(pBR322-HPV18)为模板,利用PCR方法扩增HPV18L1DNA片段,将HPV18L1DNA与质粒(pUC19)重组构建重组质粒(pUC19-HPV18L1).用酶切电泳验证重组结果的正确性;并通过测序检查质粒重组后序列有无变化.再利用质粒(pQE32)做表达载体构建重组质粒(pQE32-HPV18L1),并用酶切电泳验证.将重组质粒pQE32-HPV18L1转入工程菌(M15),用酶切电泳验证重组工程菌(pQE32-HPV18L1/M15)正确性.利用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测HPV18L1目的蛋白.采用不同浓度异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)、不同诱导时间来优化HPV18L1目的蛋白表达条件.利用Western印迹检测蛋白质(Western blot)鉴定HPV18L1目的蛋白的特异性.结果PCR扩增DNA片段约为1.7 Kb,与预期结果相同.克隆重组质粒pUC19-HPV18L1酶切后显示的酶切图谱与预期相同,而且测序验证插入片段全序列无改变.表达重组质粒pQE32-HPV18L1酶切图谱亦与预期相同.蛋白表达条件优化结果为1 mmol/LIPTG诱导4 h后,获得HPV18L1佳蛋白表达量:SDS-PAGE显示,约63KD处可见目的蛋白带,与预期结果一致.Western blot鉴定,在约63 KD处可见目的条带,与预期结果一致.结论成功构建表达重组质粒pQE32-HPV18L1并能表达HPV18L1目的蛋白.
关键词： 人乳头瘤病毒18型L1基因 基因重组 蛋白表达 -
pQE32-HPV18L1重组质粒的构建及鉴定
目的构建重组原核表达质粒获得HPV18 L1活性蛋白,为进一步研制HPV18基因工程疫苗打下基础. 方法以重组质粒pBR322-HPV 18为模板,利用PCR方法扩增HPV18 L1DNA片段,将HPV18 L1DNA与pUC19质粒重组构建pUC19 -HPV18 L1重组质粒.用酶切电泳验证重组结果的正确性;并通过测序检查质粒重组后序列有无变化.再利用pQE32质粒做表达载体构建pQE32-HPV18 L1重组质粒,并用酶切电泳验证. 结果 PCR扩增DNA片段约为1.7Kb,与预期结果相同.pUC1 9-HPV1 8 L1克隆重组质粒酶切后显示4.39Kb,酶切图谱与预期相同.测序验证插入片段全序列无改变.pQE32-HPV18 L1表达重组质粒酶切后显示其大小约5.16Kb,酶切图谱亦与预 p期相同. 结论 pQE32-HPV18 L1表达重组质粒构建成功.
关键词： 人乳头瘤病毒18型L1基因 pQE32质粒 基因重组
