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豇豆胰蛋白酶抑制剂的非融合表达纯化
目的 探索一种能获得具豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)活性、免疫原性且氨基酸序列与天然蛋白一致的CpTI蛋白表达纯化方法,为评价转CpTI水稻的安全性提供重要材料.方法 将CpTI基因克隆到PET41EK表达载体中,构建该基因的非融合表达载体PET41EK-CpTI,将表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中进行表达,对诱导表达的时间、温度及IPTG浓度进行优化获得表达产物,对表达产物进行超滤和阴离子交换纯化从而获得纯化蛋白,对获得的纯化蛋白进行免疫原性、活性及N端测序鉴定等,并测定其浓度.结果 在大肠杆菌Rosetta(DE3)、20～25℃、130r/min、0.5mmol/L IPTG、过夜诱导表达条件下,经过30kDa超滤和DAEE FF阴离子交换纯化,可以获得可溶表达量高、具有CpTI免疫原性和活性的纯化蛋白,其纯度达到95％.结论 利用本研究建立的非融合表达方法可以得到在活性、免疫原性、分子量及氨基酸序列等方面与天然CpTI蛋白基本一致的CpTI蛋白,该法简单易行,能够满足大量生产表达的要求.
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豇豆胰蛋白酶抑制剂的大量纯化和急性毒性研究
目的 用大肠杆菌大量表达豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白(CpTⅠ)并检测其急性毒性.方法 将重组表达载体pET41-CpTⅠ转化大肠杆菌,用IPTG诱导目的蛋白表达,通过疏水层析和阴离子交换层析等色谱技术纯化大肠杆菌表达的CpTⅠ蛋白.取60只ICR小鼠,随机分成6组,每组10只,雌雄各半,经口灌胃法分别一次性给予10.0、4.64、2.15和1.00g/kg BW的重组CpTⅠ蛋白,并设5.00g/kg的BSA对照蛋白组和水空白对照组,连续观察14d.结果 所有的小鼠在观察期间体重、脏器比重、进食量等均未出现显著变化,在15d大体解剖也未发现明显的病理变化.小鼠对CpTⅠ蛋白的大耐受剂量(MTD)应大于10.0g/kg BW.结论 在该试验条件下,经口灌胃法给予ICR小鼠CpTⅠ蛋白,未发现其毒性.
