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清热、活血中药调控TLR4/MyD88/NF-κB信号干预动脉粥样硬化大鼠模型的实验研究
目的:观察清热、活血中药双黄连、丹参多酚酸盐对动脉粥样硬化大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号通路表达的影响.方法:SD大鼠48只,随机分成6组(每组8只):丹参多酚酸盐(丹多酚)低剂量组、丹多酚高剂量组、双黄连低剂量组、双黄连高剂量组、模型对照组、正常对照组.除了正常组,均注射脂多糖、维生素D3并联合高脂饮食诱导大鼠动脉粥样硬化模型.实验第6周开始,干预组分别用丹参多酚酸盐和双黄连干预治疗6周,第12周实验结束后采用腹主动脉采血休克法处死动物留取标本取材进行相关指标检测.ELISA法检测血清TNF-仅、IL-6、P-selection水平;采用酶比色法检测血脂CHOL、TG、HDL-C、LDL-C水平;主动脉标本组织分别行HE染色进行病理形态学观察,分别采用免疫组化法以及western blot法检测主动脉组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达情况以及水平.结果:(1)4个药物干预组与模型组相比CHOL、TrG、LDL-C水平均降低(P＜0.05);(2)丹多酚高剂量组、双黄连高剂量组与模型组相比TNF-α水平下降(P＜0.05);丹多酚低剂量组、高剂量组和双黄连高剂量组与模型组相比IL-6水平下降(P＜0.05);丹多酚低剂量组和高剂量组与模型组相比P-selectin水平下降(P＜0.05);(3)双黄连高剂量组、丹多酚高剂量组与模型组相比TLR4、MyD88的表达均减少(P＜0.05);(4)4个药物干预组与模型组相比NF-κB表达均下降(P＜0.05),且两个药物的高剂量组均优于低剂量组(P＜0.05).结论:双黄连、丹参多酚酸盐均能通过调控动脉粥样硬化大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号转导,下调血脂水平,减轻炎症反应,从而抑制动脉粥样硬化进程.
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血管外膜局部血管紧张素II调控TLR4在高血压血管重构中的作用及机制探讨
目的 探讨血管外膜在高血压血管重构中的作用以及局部血管紧张素II通过TLR4信号途径对高血压血管重构的影响.方法去除大鼠颈动脉外膜,局部转染血管紧张素II(AngII)腺病毒质粒,观察血管结构的变化,分离SHR大鼠血管外膜单核细胞进行原代培养,研究AngII分别经TLR4信号和MYD88依赖和Trif依赖性途径,对单核细胞P38MAPK,NF-KB活性以及MCP-1表达的影响,分析AngII调控TLR4信号的主传导途径.结果 去除血管外膜能使增生内膜形成,血管外膜局部注射转染AngII的腺病毒质粒,可观察到单核细胞浸润及炎症因子MCP-1的表达,AngII经TCR4信号途径,对单核细胞P38MAPK和NF-KB活性以及炎症因子表达产生明显的影响.结论 血管外膜在高血压血管重构中起重要作用,这与局部AngII通过调控天然免疫TLR4,通过MYD88依赖性信号传导途径影响炎症因子表达有关.
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TLR4信号通过对miR-21的表达调控影响乳腺癌4T1细胞的凋亡和增殖
目的:探讨TLR4信号对乳腺癌4T1细胞株中miR-21表达的影响及调控机制,研究miR-21对乳腺癌细胞凋亡和增殖的影响.方法:体外培养乳腺癌细胞株4T1,以TLR4配体LPS刺激6、12、18、24 h,实时荧光定量PCR检测4T1细胞中miR-21的表达变化.Western blotting检测TLR4信号活化后4T1细胞中NF-κBp65的表达和磷酸化情况;应用NF-κB抑制剂PDTC预处理30 min,实时荧光定量PCR检测4T1细胞中miR-21的变化.转染miR-21抑制剂和阴性对照后,Annexin-V/PI双标法检测4T1细胞凋亡情况,MTT法检测4T1细胞增殖情况.结果:LPS刺激致TLR4信号活化能够时间依赖性地上调miR-21的表达(18 h时:2.07 ±0.33 vs1;t=5.61,P=0.03),TLR4信号能够时间依赖性地上调NF-κB的活化,NF-κB抑制剂PDTC能明显抑制TLR4信号诱导的4T1细胞的miR-21上调(0.70±0.10 vs 2.14 ±0.32;t=-7.357,P=0.002).与阴性对照组相比,miR-21抑制剂组4T1细胞的凋亡率明显增高[(24.2±2.4)％ vs (14.8±5.1)％;t=2.891,P=0.044],4T1细胞的增殖能力明显降低(0.42 ±0.02 vs0.55 ±0.01;t=-8.528,P=0.001).结论:TLR4信号通路的活化能够上调乳腺癌4T1细胞中miR-21的表达,其机制与NF-κB的活化有关;靶向抑制miR-21能有效促进4T1细胞的凋亡、抑制4T1细胞增殖.
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SiRNA干扰对高糖环境下大鼠肾小管上皮细胞Toll样受体4/转接子髓分化因子88信号通路的影响
目的 通过siRNA(RNAi)干扰选择性下调TLR4基因的表达,探讨高糖对大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)及其转接子髓分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)和炎性因子分泌的影响.方法 设计并合成3对针对大鼠TLR4基因的特异性siRNA片段,以带有红色荧光的BLOCK-IT Alexa Fluor作为阴性对照,荧光显微镜下观察细胞转染效率,实时定量PCR检测TLR4 mRNA的表达变化.挑选基因沉默效率佳的siRNA用于进一步实验,细胞被分5组:(1)正常糖对照组(NG);(2)高糖组(HG);(3)HG+血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)+空转组;(4) HG+AngⅡ+siRNA组;(5) HG+AngⅡ+厄贝沙坦(IrB)组.采用实时定量PCR法检测TLR4、MyD88 mRNA的表达,Western印迹检测TLR4、MyD88及核因子kappa B(NF-kB)蛋白表达;ELISA法检测巨噬细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素6(IL-6)的表达.结果 与NG组比较,高糖组TLR4/MyD88 mRNA及TLR4、MyD88、NF-kB蛋白表达水平明显上调(均P＜ 0.01),细胞上清MCP-1、IL-6水平亦升高(P＜0.01);空转组与高糖组比较差异无统计学意义(P＞ 0.05);SiRNA组、ARB组TLR4、MyD88 mRNA明显下调,TLR4、MyD88及NF-kB蛋白明显下调,MCP-1、IL-6表达亦下调(均P＜0.01).结论 高糖上调小管上皮细胞TLR4/MyD88信号及炎性细胞因子表达,AngⅡ可增强此效应;特异性基因沉默可阻断由高糖及AngⅡ诱导的TLR4信号通路的激活,并下调炎性介质的释放;TLR4信号通路在高糖、高肾素环境肾小管上皮细胞炎性反应机制中发挥关键作用.
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大黄素抑制NAFLD大鼠肝脏TLR4信号表达的研究
目的 探讨大黄素改善非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠模型肝脏脂质沉积的机制.方法 大鼠随机分为正常对照组,NAFLD模型组,大黄素低、中、高(20,40,80 mg· kg-1)剂量组,每组8只.采用高脂诱导的方法建立NAFLD大鼠模型,采用HE染色法检测肝脏病理变化,酶联免疫法检测血清TNF-α、IL-1含量,实时定量PCR法和免疫组化染色法检测TLR4信号的表达.结果 NAFLD组大鼠呈现典型的肝细胞脂滴空泡,部分肝细胞有单核细胞浸润,与正常对照组比较,血清TNF-α、IL-1增高(P＜0.05),肝脏TLR4、MyD88、TRAF-6的基因表达增高(P＜0.05).与NAFLD模型组比较,大黄素各剂量组对NAFLD大鼠肝脏脂滴空泡均有显著改善,抑制血清TNF-α、IL-1分泌(P＜0.05),并抑制肝脏TLR4的表达(P＜0.05),大黄素中、高剂量组抑制肝脏MyD88和TRAF-6的表达(P＜0.05).结论 大黄素改善NAFLD模型肝脏脂质沉积的机制与抑制肝脏TLR4信号有关.
