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电镜样品制备过程中四氧化锇的改进保存法
在医学、生物学电镜研究工作中,四氧化锇是一种几乎必不可少而又很昂贵的固定剂.四氧化锇是一种强氧化剂,容易被热和光促进氧化,须于冷暗处保存,并有强烈的挥发性,其蒸气有剧毒作用,极易挥发.因此平时不易保存,一般电镜技术著作,都介绍用密合的暗色磨口瓶冰箱内保存四氧化锇固定液.但有时瓶口稍有不严或关闭时疏忽,即有蒸气逸出,使固定液内四氧化锇含量下降,又易与冰箱内其它物品发生化学作用,还可将冰箱内壁熏黑后溶液没用完就变色失效,造成浪费,尤其规模较小的实验室,工作量很少,但又必须用此固定液,配制后又不能立即用完,所以溶液的保存问题,尤为重要.
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超声波在电镜样品制样过程中的应用
骨组织尤其是密质骨 ,其矿物质(又称骨盐)干重约占骨的65%～75%.其中95%是固体钙和磷,钙磷固体以结晶的羟基磷灰石形式存在,不溶于水,它使骨质十分坚硬,采用常规电镜样品制样方法 ,超薄切片困难,因此用于电镜观察的骨组织通常都需经过脱钙处理.络合剂乙二胺四乙酸 (ethylene diamine tetraacetic acid,简称EDT A)是常用的脱钙剂.对于1×3×0.2mm3体积的骨片,在常温下EDTA常规的脱钙时间需20d左右,致使骨标本的电镜制样周期很长.实验过程中我们发现应用超声波对骨组织进行脱钙,可大大缩短骨标本的电镜制样周期.取正常SD大鼠股骨中段,剪成面积约1×3mm2的小骨片,迅速投入4%甲醛-5 %戊二醛混合固定液中(0.1mol/L磷酸缓冲液配制,pH7.4),4℃固定2h 以上,再用0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗3次,每次15min,分成二组进行脱钙. ①超声实验组:样品投入5%脱钙液,并用21kHz超声波,水浴内对浸泡在脱钙液内的样品进行连续辐照,持续时间为20min,随后静置在室温.如此超声辐照每天一次,持续7d.每隔24h更换脱钙液一次.②对照组:依常规脱钙程序,样品投入脱钙液于室温静置,每隔24h更换脱钙液一次,持续20d.脱钙后的样品,经磷酸缓冲液漂洗,1% 四氧化锇后固定2h,梯度乙醇逐级脱水,丙酮置换,国产618环氧树脂浸透后包埋,L eica公司 Reichert Ultrcut E超薄切片机切片(切片厚度约60n m),醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色,后经JEOL公司JEM-1200EX透射电镜观察、摄片.实验结果表明,经超声脱钙7d实验组的骨组织在切片过程中未遇困难,电镜下观察,间质胶原微纤维上未见无机盐结晶,周期性横纹清晰可辨,骨陷窝内的骨细胞保存完好,未发现线粒体与内质网的形态改变.细胞核卵圆形,核膜完整,基本达到了与常规方法脱钙相同的实验效果.说明超声EDTA方法是一种简便、有效的骨组织脱钙技术.因而克服了常规骨组织电镜样品制备周期长的缺点.
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细胞色素氧化酶的DAB法与Nadi反应的比较
过去常用经典的Nad i反应显示细胞色素氧化酶以定位线立体的存在部位,现在广泛使用DAB法.我们对这两种方法进行了比较.方法如下:取Wistar大鼠的心、肝、肾组织,用液氮骤冷,恒冷箱切片(厚7μm),进行以下实验:Nadi反应:切片入孵育液(N-苯基-对-苯二胺3mg、1-羟基-2-萘酸3mg 溶于二甲基亚砜0.1ml,0.05M的磷酸缓冲液pH7.2 10ml,混匀后过滤 )室温30min.入Lugol碘液2min,入5%硫代硫酸钠4min,入1%醋酸钴60min,蒸馏水洗,甘油明胶封固.DAB法:切片入孵育液(0.05M磷酸缓冲液pH7.2 10ml,3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)9mg,细胞色素C 15mg,混匀后过滤)室温5min .切片用缓冲液清洗,入蒸馏水,甘油明胶封固.HE染色:切片先用10%Formalin固定10min,再做常规HE染色.对照:Nadi反应和DAB法都用迭氮钠预孵育5min(10ml缓冲液中含6mM迭氮钠),再入含6mM迭氮钠的孵育液中孵育,以下的步骤与上述步骤相同.DAB法还用不含细胞色素C的孵育液做对照.实验结果:HE染色的切片显示组织结构正常.Nadi反应的阳性产物为黑绿色的颗粒, 可见弥散的现象.DAB染色的阳性产物为棕色颗粒,很少见有弥散现象.对照切片的结果:用迭氮钠制酶活性的Nadi反应有弱阳性产物,而用迭氮钠的DAB法细胞色素C的切片均呈阴性反应.我们认为显示细胞色素氧化酶的经典方法Nadi反应存在反应产物弥散的现象,用迭氮钠抑制酶的活性后仍有阳性产物出现,因而该法只能表明线粒体的存在,而其定位不够准确.DAB法的方法简便,反应产物不易扩散,可较准确地定位线粒体的存在部位.另外,DA B的沉淀物能与四氧化锇反应形成锇黑,可用于电镜观察.经以上的实验观察和比较,我们认为无论从反应的特异性、定位的准确性,还是电镜应用性等方面看,显示细胞色素氧化酶的DAB法都优于Nadi反应.
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改良的锇酸脂肪染色法
锇酸亦称四氧化锇,是一种金属氧化物,为无色结晶体,价格昂贵.市售包装有0.5g和1g等,均以玻璃管密封.
