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构建pcDNA3.1/Hygro(+)-Lefty A真核表达载体及Lefty A的稳定表达细胞系
背景:Leffy基因可能通过拮抗转化生长因子β1,信号通路发挥抗肾纤维化作用.目的:为验证其抗纤维化作用,构建pcDNA3.1/Hygro(+)-LeffyA真核表达载体,并建立LeftyA稳定表达细胞系.设计、时间及地点:基因克隆构建,单一样本观察,于2008-04/07在武汉大学人民医院中心实验室完成.材料:人肾小管上皮细胞株购于中国协和医科大学细胞库;真核表达载体pcDNA3.1/Hygro(+)由美国纽约州石溪大学SiamakTabibzadeh教授惠赠;Leffy A克隆载体pCMV-SPORT6购自武汉晶赛公司.方法:以pCMV-SPORT6为模板经PCR反应获得Leffy A编码区DNA,将其插入pcDNA3.1/Hygro(+)中构建Leffy A真核表达载体;通过LipofectamineTM2000将此重组质粒转染入人肾小管上皮细胞中,通过Hygromycin筛选挑取阳性表达克隆从而构建Leffy A稳定表达细胞系.主要观察指标:PCR扩增产物电泳鉴定结果.重组质粒的酶切鉴定结果.重组质粒基因测序结果.Leffy A稳定表达细胞系的筛选及其细胞内Leffy A mRNA表达.结果:pCMV-SPORT6经针对人Leffy A基因编码区序列的上下游引物PCR扩增后,10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测,在10 kb条带处出现稍大于1.0 kb的特异性扩增条带,与预期1.1 kb目的片段大小相符.重组质粒分别被Hind Ⅲ、BamH Ⅰ单酶切后所得片段大小一致,均为6.7 kb,与重组质粒理论大小一致;经双酶切后得到大小分别为5.6 kb和1.1 kb的2条片段,与pcDNA3.1/Hygro(+)及Leffy A片段大小相符.将酶切鉴定阳性重组质粒测序,对测序结果进行生物信息学分析,发现与人Leffy A基因编码区序列完全一致.稳定转染Leffy A重组质粒的人肾小管上皮细胞高表达Leffy A mRNA.结论:pcDNA3.1/Hygro(+)-Leffy A真核表达载体构建成功,并建立了Lefty A稳定表达细胞系.
