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生物蛋白胶双相接种法促进组织工程骨构建的观察
背景:很多学者采用生物蛋白胶修饰无机支架材料改善其细胞黏附能力,并证实该方法能有效促进骨髓间充质于细胞与支架材料黏附.目的:观察采用生物蛋白胶双相接种技术促进绢织工程骨体外构建的可行性.设计、时间及地点:细胞生物学水平实验,2003-01/2008-10在解放军第三军医大学组织工程研发中心实验室完成.材料:医用生物蛋白胶为广州倍特生物技术有限公司产品,同种异体冻干脱钙骨基质由解放军第三军医大学两南医院骨组织库提供.方法:以生物蚩自胶为介质,用双相接种技术将羊骨髓间充质干细胞与同种异体冻干脱钙骨基质复合,在体外构建组织工程骨,以静置接种法作为对照.主要观察指标:通过细胞计数及MTT观察不同接种密度生物蛋白胶双相接种法所构建的组织工程骨细胞数量,并通过相差显微镜和扫描电微观察细胞在支架材料中的分布情况.结果:双相接种法在不同接种密度时都可保持细胞黏附率维持在80%左右,上架细胞的数量随接种细胞密度增加成比例增加:生物蛋白胶对细胞的增殖没有明显影响,提高接种密度使细胞生长曲线提前达到平台期,各组的细胞数量峰值接近.结论:双相接种技术可显著提高种子细胞与支架材料的复合数量、复合效率并且分布均匀,是一种工程骨快速高效组织的构建方法.
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两种构建方法对组织工程骨种子细胞粘附和增殖的影响
目的比较普通的静置接种法和双相接种法在组织工程构建中的差异,探索更佳的体外构建策略.方法采用静置接种法和双相接种法将不同浓度的羊间充质干细胞分别与同种异体冻干脱钙骨基质复合,体外构建组织工程骨,通过相差显微镜、光镜、扫描电镜观察及MTT检测等,了解细胞在材料中的粘附、生长情况.结果两种方法均能使细胞在支架上较好的粘附、铺展、增殖,但单纯静置接种的接种细胞密度超过2×l06/ml时上架细胞数不再增加、上架率低(＜76%);双相接种法用于更高的接种密度,可明显提高细胞的上架率((80%).结论生物蛋白胶辅助的双相接种法可突破普通方法上架率低、即时上架细胞有限的瓶颈,不影响细胞的生长,是一种更佳的组织工程骨体外构建策略.
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双相接种技术构建组织工程骨的异位成骨观察
目的评价双相接种技术体外构建的组织工程骨在体内的成骨潜力和这种体外构建策略的可行性.方法8只山羊抽取自体骨髓体外扩增、定向成骨诱导,再分别采用静置接种法和双相接种法将羊骨髓间充质干细胞(mesenehymal stem cells,MSCs)与脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)复合,复合培养5 d;将这两种方法构建的组织工程骨分别植入羊的背部肌袋内,同时植入单纯DBM作为阴性对照;术后2、8周取标本,进行大体观察、组织学染色检查和免疫组织化学检测.结果双相接种技术体外复合MSCs与DBM构建组织工程骨,细胞在支架上体外生长情况优于普通方法,植入山羊肌肉内术后2周观察到异位成骨,并随时间延长成骨量增加,其组织学半定量评分术后2周为(2.46±0.32)、8周为(4.13±0.42),明显优于普通方法的术后2周(1.96±0.21)、8周(3.66±0.37)(P＜0.01).植入后的组织工程骨材料边缘均可检测到BrdU标记阳性的细胞.单纯DBM植入未见成骨表现,亦无BrdU标记阳性的细胞.结论双相接种技术有利于组织工程骨在体内的成骨,是一种值得推广的组织工程骨体外构建技术.
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组织工程骨修复山羊负重骨大段缺损
目的 研究组织工程骨结合带锁髓内钉修复成年山羊大段负重骨缺损的可行性,探索更可行的技术路径.方法 将24只成年山羊,通过骨髓穿刺法获取山羊骨髓间充质干细胞(BMSC),将体外扩增及成骨定向诱导的第2代BMSC与同种异体脱钙骨基质(DBM)通过双相接种法构建组织工程骨.24只成年山羊,以带锁髓内钉构建股骨中段3 cm骨缺损模型.随机分为3组,每组8只.实验组以组织工程骨修复骨缺损,对照组单独使用DBM和空白组旷置.术后1、12、24周行X线片观察及评分,12、24周每组各处死4只动物行组织学观察和生物力学检测.结果 标本大体观察示实验组和对照组术后12周骨缺损部位被骨痂连接,髓腔贯通,24周全部愈合；实验组24周恢复正常解剖形态,对照组外形仍然粗糙、不规则；空白组术后12周及24周缺损部位均为纤维组织充填.术后1周各组X线评分无明显差异(P＞ 0.05),实验组术后12周及24周X线评分均优于对照组和空白组,对照组优于空白组,各组24周X线评分均高于12周时,差异均有统计学意义(P＜ 0.05).实验组术后12、24周的大抗扭强度分别达正常侧的47.07％±5.05％和83.73％±2.33％,显著高于对照组和空白组(P＜0.05)；空白组2个时间点大抗扭强度均不超过正常的15％,与骨不连时的纤维连接相符.组织学检查示术后12周实验组和对照组骨缺损区DBM支架材料基本被吸收,有典型的同心圆排列的哈弗系统形成,周围偶见淋巴细胞；术后24周,实验组和对照组股骨缺损均被修复,但实验组较对照组的新骨更多、骨塑形更好；空白组术后24周骨缺损区中央仍为纤维组织填充.结论 组织工程骨结合带锁髓内钉能够更有效修复成年山羊负重骨大段骨缺损,满足负重骨的生物力学要求.
