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体外静水压环境下细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化
背景：骨髓间充质干细胞的诱导分化受到综合因素的共同作用，体外通过一定的细胞力学刺激结合细胞因子复合体共同作用，以期进一步提高干细胞髓核样细胞分化的效率。目的：观察在体外静水压环境下转化生长因子β1联合类胰岛素生长因子1诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞表型分化的效果。方法：取成年大鼠骨髓间充质干细胞，体外培养、分离及纯化，传代至第3代后分为：静压药物组在体外静水压加载系统中运用转化生长因子β1联合类胰岛素生长因子1诱导骨髓间充质干细胞分化；单纯药物组在体外常压环境下使用转化生长因子β1联合类胰岛素生长因子1诱导干细胞分化；空白对照组将骨髓间充质干细胞置于体外常压环境下普通培养基中培养。结果与结论：培养14 d时，静压药物组可见多角形的髓核样细胞，单纯药物组细胞呈不规则形，空白对照组细胞变化不明显。静压药物组细胞中Ⅱ型胶原蛋白及DNA含量高于其他2组。说明在静水压环境下转化生长因子β1联合类胰岛素生长因子1可成功诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化，且诱导效率高于常压。
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牛膝提取物对大鼠骨髓间充质干细胞向髓核样细胞增殖与分化的影响
目的 研究牛膝提取物对大鼠骨髓间充质干细胞向髓核样细胞增殖与分化的影响.方法 分离培养原代大鼠骨髓间充质干细胞后,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分成对照组和牛膝提取物组(10、30、50 μg/mL).培养14 d后,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,阿利新蓝法检测葡糖胺聚糖含有量,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)、免疫印迹(Western blot)检测细胞中Sox-9、Ⅱ型胶原(ColⅡ)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)水平.SIRT1抑制剂(尼克酰胺)处理细胞,MTT法检测细胞增殖,RT-PCR和免疫蛋白印迹检测SIRT1、Sox-9水平.结果 骨髓间充质干细胞表面CD90和CD44呈阳性表达,而CD45和CD34呈阴性表达.与对照组比较,牛膝提取物可显著促进骨髓间充质干细胞细胞增殖,抑制细胞凋亡,上调细胞葡糖胺聚糖含有量及Sox-9、ColⅡ、Aggrecan水平,以上差异均有统计学意义(P＜0.05),并呈剂量依赖效应.另外,尼克酰胺可抑制牛膝提取物诱导的骨髓间充质干细胞细胞增殖和Sox-9表达升高.结论 牛膝提取物可通过上调SIRT1水平来促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞增殖与分化.
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脂肪间充质干细胞向髓核样细胞诱导分化的初步研究
[目的] 定向诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化为髓核样细胞,为椎间盘退变性疾病的细胞移植治疗奠定生物学基础.[方法] (1)200 g SD雄性大鼠断颈处死后,取腹股沟脂肪垫处脂肪,0.1%胶原酶消化,体外接种培养,同时采用极限稀释法纯化细胞;(2)利用流式细胞技术对细胞表面标记进行鉴定;(3)第3代细胞消化计数后,用1.2%海藻酸钠溶液悬浮,调整细胞密度至1×10~6/ml,滴入3.5%CaCl_2溶液形成微球,加入含TGF-beta1的诱导培养基,低氧条件下进行微球联合培养;(4)7 d后,取部分微球进行Alcian Blue染色并收集微球内细胞提取RNA,进行RT-PCR检测.[结果] (1)体外培养的脂肪间充质干细胞主要呈梭形和多角形,核大、核仁明显,平行排列生长或呈漩涡状生长;(2)流式细胞仪检测显示Sca-1、CD44的阳性率分别为95.2%、99.7%,CD45、CD11b的阳性率分别为0.4%、1.5%;(3)微球联合培养7 d后,Alcian Blue染色表明,实验组细胞外基质的生成明显多于对照组;(4)RT-PCR结果证实,髓核细胞标志基因和软骨细胞标志基因的表达,实验组明显高于对照组.[结论] (1)本实验方法可以获得大量均一的脂肪间充质干细胞;(2)脂肪间充质干细胞可以被定向诱导分化为髓核样细胞;(3)首次探讨了将脂肪间充质干细胞体外诱导后移植治疗椎间盘退变性疾病,为椎间盘退变性疾病的干细胞移植治疗提供了新的思路.
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miR146通过靶向Notch1促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化
目的 探讨miR146在骨髓间充质干细胞(BMSC)向髓核样细胞分化中的作用及其机制.方法 从SD大鼠中分离培养BMSC,传至第3代用于本实验.以TGFβ1(转化生长因子-β1)诱导BMSC向髓核样细胞分化为模型.检测TGFβ1诱导BMSC后蛋白多糖(ACAN)、Ⅱ型胶原蛋白(COLⅡ)和SOX 9的蛋白及mRNA表达水平;RT-PCR检测miR146的表达水平.随后通过上调或下调miR146水平,检测ACAN、COLⅡ和SOX 9的蛋白及mRNA表达水平;双荧光素酶报告系统验证miR146的靶基因,并上调或下调miR146水平后检测靶基因的蛋白表达水平;过表达靶基因并检测其与miR146 mimic共转染对ACAN、COLⅡ和SOX 9表达的影响.后,上调或下调靶基因后,检测miR146表达水平的变化.结果 TGFβ1诱导BMSC向髓核样细胞分化后ACAN、COLⅡ、SOX 9和miR146高表达.上调miR146后,ACAN、COLⅡ和SOX 9的表达升高;下调miR146后ACAN、COLⅡ和SOX 9的表达降低.双荧光素酶报告系统证实,Notch1是miR146的靶基因,miR146通过抑制Notch1的表达上调ACAN、COLⅡ和SOX 9的表达水平.上调Notch1后miR146表达下调,下调Notch1后miR146表达上调.结论 miR146通过靶向Notch1促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化,Notch1对miR146亦具有负向调控作用.
