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转化生长因子β1诱导人肾小管上皮细胞转分化：Notch1受体阻断剂的影响
背景：研究发现，在病理状态下各种细胞可通过转化生长因子β1的介导，促进肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化为肌成纤维细胞，进而加速肾小管间质纤维化的进展。
目的：验证Notch1受体特异性阻断剂γ-分泌酶抑制剂DAPT能否有效阻断、部分逆转或者完全逆转转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化。
方法：以体外培养的人近端肾小管上皮细胞株HK-2细胞为观察对象，建立转化生长因子β1诱导的肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化体外模型，实验分为空白对照组、10μg/L转化生长因子β1组、转化生长因子β1(10μg/L)+γ-分泌酶抑制剂DAPT(5μmol/L)组、转化生长因子β1(10μg/L)+γ-分泌酶抑制剂DAPT(5μmol/L)部分延迟加入组、转化生长因子β1(10μg/L)+γ-分泌酶抑制剂DAPT(5μmol/L)延迟加入组。分别于12，24，48，72 h，在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化；用免疫组织化学法和RT-PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白、E-钙粘连素蛋白和mRNA表达变化。
结果与结论：①在干预后在12，24，48，72 h，与空白对照组相比较，转化生长因子β1组α-平滑肌肌动蛋白蛋白和mRNA表达均明显增加(P <0.05), E-钙粘连素蛋白和mRNA表达逐渐减少(P <0.05)。②转化生长因子β1+γ-分泌酶抑制剂DAPT组α-平滑肌肌动蛋白的蛋白和mRNA、E-钙粘连素蛋白和mRNA的表达各时间段均接近空白对照组(P >0.05)。③γ-分泌酶抑制剂DAPT部分延迟加入组，α-平滑肌肌动蛋白的蛋白和mRNA的表达在12 h增加(P <0.05)，之后其表达逐渐减少(P <0.05)，E-钙粘连素蛋白表达在24 h开始减少(P <0.05)，之后逐渐增加，E-钙粘连素mRNA各时间段都与空白对照组相接近，72 h时α-平滑肌肌动蛋白与E-钙粘连素的蛋白及mRNA表达均与空白对照组无显著差异(P >0.05)。④与空白对照组相比较，延迟加入组各时间点的α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达逐渐增加(P <0.05), E-钙粘连素蛋白的表达逐渐减少(P <0.05)，但72 h时E-钙粘连素蛋白表达接近空白对照组。结果表明Notch1受体阻断剂γ-分泌酶抑制剂DAPT能够阻断、部分逆转转化生长因子β1所诱导的肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化，但不能完全逆转其所诱导的肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化。 -
DAPT 及顺铂对人卵巢癌 HO8910细胞生物学性能的影响
目的：观察γ-分泌酶抑制剂DAPT及顺铂对人卵巢癌HO8910细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的影响，为卵巢癌治疗提供新思路。方法常规培养HO8910细胞至对数生长期，随机分为DAPT组、顺铂组、联合组及对照组，前三组分别以不同质量浓度DAPT、顺铂及DAPT＋顺铂处理，采用四甲基偶氮唑蓝（ MTT）比色法检测细胞增殖情况，倒置显微镜观察细胞形态变化，流式细胞仪检测细胞凋亡率，体外迁移及侵袭实验检测细胞迁移及侵袭能力。结果与对照组比较，DAPT组、联合组细胞增殖明显受抑（P均＜0．05），且呈DAPT作用时间和剂量依赖性，尤以联合组为著（P＜0．05）；倒置显微镜下对照组细胞形态正常，DAPT组及联合组均出现细胞密度减低及凋亡现象；DAPT组、顺铂组、联合组细胞凋亡率均显著高于对照组（P均＜0．05），尤以联合组为著（P均＜0．05）；与对照组比较，余三组细胞迁移抑制率、细胞侵袭抑制率均显著升高（P均＜0．05），尤以联合组为著（P均＜0．05）。结论DAPT 与顺铂可协同抑制人卵巢癌HO8910细胞增殖、促进细胞凋亡、降低细胞侵袭及迁移能力，此为卵巢癌的治疗提供了新思路。
关键词： 卵巢癌 Notch信号通路 γ-分泌酶抑制剂DAPT 顺铂 -
γ-分泌酶抑制剂对毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞效率的影响
目的 观察Notch信号通路的特异性阻断剂——γ-分泌酶抑制剂(DAPT)对毛囊干细胞(rHFSCs)诱导分化为血管内皮细胞(ECs)效率的影响.方法 运用改良的rHFSCs分离培养、纯化鉴定的方法得到种子细胞,并用透射电镜观察其内部结构.用10μg/L血管内皮生长因子165(VEGF165)作为诱导因子进行诱导,流式细胞仪检测分化效率.用不同浓度DAPT(0.5、1.0μmol/L)进行抑制,将他们分为诱导组和抑制组.两组细胞均处理1周,用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和Western blot法分别检测两组 CD31、血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin) mRNA和蛋白表达,联合DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)吞噬功能检测和体外成血管实验形成实验进行对比,综合评价DAPT在抑制Notch信号通路后对rHFSCs诱导分化为ECs的影响.结果 改良分离、培养、纯化的rHFSCs克隆能力好,活力强.流式细胞仪检测β1、α6整合素、细胞角蛋白15(CK15)、p63呈高表达,分别为98.9%、97.9%、68.1%和98.5%;低弱表达CD31、VE-cadherin,分别为13.6%和17.9%;透射电镜显示细胞处于原始状态.诱导1周后,流式细胞仪检测高表达内皮细胞标志物CD31和VE-cadherin,分别为61.5%和95.9%.抑制Notch信号通路后两组FQ-PCR结果显示,CD31变化差异无统计学意义(P=0.136)、VE-cadherin mRNA 变化差异有统计学意义(P=0.003),Western blot法得到CD31、VE-cadherin蛋白表达明显降低(P=0.000),体外Dil-ac-LDL吞噬功能,成血管形成能力明显减弱.结论 DAPT通过阻断Notch信号通路,虽没有显著影响 CD31、VE-cadherin mRNA水平,但能较好抑制CD31、VE-cadherin蛋白表达,体外吞噬和成血管的能力,从而减低rHFSCs诱导分化为ECs的效率.
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γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制Jurkat T细胞增殖
目的:探讨γ-分泌酶抑制剂DAPT在体外对人T淋巴细胞白血病Jurkat T细胞株增殖的抑制作用及其某些机制.方法:通过倒置显微镜和MTT法检测DAPT对Jurkat T细胞聚集的影响和对其增殖的抑制作用;利用碘化丙锭染色结合流式细胞术检测DAPT对Jurkat T细胞周期的影响;藉免疫印迹法检测DAPT对Jurkat T细胞周期蛋白ICBP90表达的影响.结果:DAPT能显著影响Jurkat T细胞的聚集,抑制Jurkat T细胞的增殖,使其细胞周期停滞于S期,且周期蛋白ICBP90的表达下调.结论:γ-分泌酶抑制剂DAPT能够抑制Jurkat T细胞的增殖和细胞周期的进行,其抑制作用可能与ICBP90蛋白表达的下调有关.
