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逆转录病毒载体介导人胰岛素样生长因子Ⅰ在大鼠成肌细胞中的表达及分泌
目的:将经逆转录病毒载体的介导的人胰岛素样生长因子Ⅰ基因导人大鼠成肌细胞,观察其是否表达,为组织工程人工肌肉体内基因治疗打下基础.方法:实验于2005-10/2006-12在华中科技大学同济医学院协和医院心血管病研究所完成.①实验材料:PLghlGF1SN由本实验室保存,逆转录病毒包装细胞系GP+E86购自Clontech公司,包装细胞PT67购自ATCC.②实验方法:选用新生SD乳鼠骨骼肌进行成肌细胞的原代培养,选用新生SD乳鼠心脏进行心肌细胞的培养.通过脂质体2000将人胰岛素样生长因子Ⅰ c DNA导入逆转录病毒包装细胞PT67,经过G418筛选获取稳定表达病毒的克隆,NIH3T3细胞测定病毒滴度,挑取滴度高的克隆扩增,收取高滴度的病毒上清液,转染成肌细胞.③实验评估:G418筛选转染过的成肌细胞,采用ELISA方法检测其上清液中人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达,采用MTT法检测人胰岛素样生长因子Ⅰ的生物学活性.结果:①病毒滴度的测定:利用不同量的病毒上清感染1×105 NlH3T3细胞,并经G418筛选,测得不同PT67克隆的培养上清中,病毒滴度高为8×105 cfu/mL.②ELISA方法检测人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达:在转染后大鼠成肌细胞分泌的上清液中可以检测到人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达,经过G418筛选2周后,收集培养液,人胰岛素样生长因子Ⅰ浓度高在40 μg/L,总量可以达到(150～200)ng/2×106/d.未转染成肌细胞组人胰岛素样生长因子Ⅰ浓度约在0.3 μg/L.③MTT法检测人胰岛素样生长因子Ⅰ的生物学活性:转染的成肌细胞培养上清液刺激心肌细胞后,心肌细胞活力明显增加.结论:人胰岛素样生长因子Ⅰ基因可在鼠成肌细胞内稳定表达并具有生物学效应,可用于心血管系统基因治疗的研究.
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利用周期性静水压在水力聚焦生物反应器中构建组织工程软骨
目的 探讨在水力聚焦生物反应器(HFB)中加载周期性静水压构建组织工程软骨.方法 分离培养兔关节软骨细胞并接种到PLGA支架上,细胞支架复合物分为加载周期性静水压的实验组和不加压的对照组,加压组的条件为:频率0.1 Hz,压力0～200 kPa, 每天加压8 h, 两组均在HFB生物反应器中培养2周,利用免疫组织化学、RT-PCR、生物化学等方法观察周期性静水压对HFB生物反应器中构建的组织工程软骨的影响.结果 免疫组织化学显示加压组的Ⅱ型胶原和甲苯胺蓝的染色面积明显大于对照组(P<0.001).RT-PCR显示加压组的Ⅱ型胶原、聚合素的表达高于对照组(P<0.001), 但Ⅰ型胶原的表达低于对照组(P<0.05).生物化学定量检测显示加压组的总胶原和糖胺多糖(GAG)的含量显著高于对照组(P<0.001).结论 周期性静水压对HFB生物反应器中构建的组织工程软骨具有显著的促进促进作用,并且稳定了软骨细胞的表型.
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携带hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体构建
目的 探讨构建携带hIG-Ⅰ基因腺病毒载体的可行性.方法 从pcDNA 3.1-hIGF-Ⅰ质粒中克隆出hIGF-Ⅰ基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdshuttle-CMV,获得重组质粒pAdshuttle-CMV-hIGF-Ⅰ,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-IGF-Ⅰ.鉴定后,将pAdeasy-1-IGF-Ⅰ转染人胚肾细胞(Ad293细胞),获得含hIGF-Ⅰ基因的重组腺病毒(rAd-hIGF-Ⅰ).再鉴定后,Ad293细胞反复感染冻融扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度.将病毒颗粒感染绿猴肾成纤维细胞(COS-7细胞),荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,RT-PCR分析hIGF-Ⅰ基因在mRNA水平的表达,Western blot分析hIGF-Ⅰ在蛋白水平的表达.结果 成功构建出含有hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ,转染COS-7细胞后发现绿色荧光蛋白表达,同时RT-PCR扩增出318 bp的目的 条带,Western blot得到7.6kDa大小的同的蛋白,证明了腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ能成功转染COS-7细胞,hIGF-Ⅰ基因能在其中成功表达.结论 成功构建出含有hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ,并且证实其能对COS-7细胞进行有效转染,为组织工程软骨的进一步改良提供了高效的基因载体.
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人胰岛素生长因子1的原核表达及其单克隆抗体的制备
目的 原核表达、纯化人胰岛素样生长因子1 (hIGF-Ⅰ),并制备其单克隆抗体(mAb).方法 通过RT-PCR方法从人体肝脏组织中扩增得到hIGF-Ⅰ基因片段,构建重组原核表达质粒pET-28a(+)/hIGF-Ⅰ,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达.将表达蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,取其脾脏和小鼠杂交瘤细胞融合制备针对hIGF-Ⅰ的特异性单克隆抗体.结果 成功表达出了hIGF-Ⅰ蛋白.SDS-PAGE电泳显示所表达蛋白质的相对分子量(Mr)大小约为18 KD.获得了1株能够稳定表达抗hIGF-Ⅰ抗体的杂交瘤细胞株(8F2),其分泌的mAb的IgG亚类(型)为IgG2b,ELISA检测,对应腹水mAb的效价分别为1:7.5× 105.Western-blot结果显示抗hIGF-Ⅰ mAb具有良好的特异性.结论 成功制备了抗hIGF-Ⅰ mAb,为进一步研究IGF-Ⅰ在肿瘤治疗中的作用提供了有力的工具.
