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香菇Latcripin-8蛋白的表达、纯化及抗肿瘤活性
目的 通过生物信息学方法分析Latcripin-8的基因序列、功能域片段,构建重组质粒,表达含Pkinase结构域基因的目的蛋白并研究重组蛋白的抗肿瘤活性.方法 从香菇C91-3菌丝体中提取总RNA,经反转录成cDNA文库.高通量测序获得转录组mRNA,经对比获得目的序列后以RACE技术扩增.经Pfam数据库比对可知其具有Pkinase结构域.设计引物,PCR扩增并与原核表达载体pET32a(+)进行连接,转至E.coli Rosetta-gami (DE3)中进行蛋白诱导表达,经纯化、复性后获得目的蛋白并鉴定.CCK8法检测其对人肺腺癌A549细胞、人胃癌SGC-7901细胞、人肝癌HepG2细胞及人乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制率.结果 蛋白诱导成功且该蛋白对不同种类的肿瘤细胞抑制效果不同,其中对人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制程度为明显,并表现出时间和浓度依赖性.结论 经Latcripin-8基因诱导表达出的蛋白具有抗肿瘤功效,为进一步深入研究抗肿瘤方面的活性提供了初步条件,有助于肿瘤治疗作用的研究.
关键词： 香菇C91-3 Latcripin-8基因 原核表达 抗肿瘤 -
香菇转录本Unigene 10627过氧化物酶结构域的克隆表达及抗氧化活性研究
目的 分析香菇C913转录本Unigene 10627基因的结构域,并对其进行诱导表达,初步探讨所得目的蛋白的抗氧化活性.方法 将香菇C913菌丝体中总RNA提取出来,通过反转录获得cDNA文库,根据反转录结果,通过3'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends),5'-RACE技术扩增获取基因全长.通过生物信息学方法预测基因的结构域,利用PCR技术扩增该目的片段,将扩增产物连接到原核表达载体pET32a(+)上,采用热转化法转至E.coli Rosetta-gami (DE3)中进行诱导表达,对目的蛋白进行分离、纯化及鉴定.采用二苯代苦味酰自由基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)法检测蛋白的抗氧化活性.结果 成功获得基因全长,预测结果表明该基因具有染料脱色过氧化物酶结构域(DyPPerox),双酶切结果证实目的片段成功插入,并通过诱导表达获得目的蛋白.结论 目的蛋白成功表达,且具有抗氧化活性,为进一步研究其生物学活性提供基础.
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香菇 C91－3转录组 Unigene 28447基因的蛋白表达及其对细胞凋亡和周期的影响
目的：克隆香菇C91－3转录组中Unigene 28447基因，对其进行生物信息学分析，并研究该基因结构域的生物学活性。方法提取香菇C91－3菌丝体中的总RNA，用3′－Full RACE、5′－Full RACE方法获得香菇菌丝体Unigene 28447基因全长；构建基因表达载体，进行原核诱导表达，将表达蛋白进行纯化、复性。运用MTT法、流式细胞仪法研究蛋白对肿瘤细胞生长、周期及凋亡的影响。结果成功构建重组质粒pET32a（＋）－Unigene，诱导重组蛋白表达，并进行纯化、复性。 MTT法显示不同浓度蛋白对肿瘤细胞的生长抑制作用与对照组比较差异均有显著性意义（P＜0．05），流式细胞仪显示此蛋白具有诱导肿瘤细胞改变周期和凋亡的作用（P＜0．05）。结论初步鉴定Unigene 28447基因的结构域具有抗肿瘤活性。
