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依达拉奉对氧剥夺引起的大鼠肠隐窝上皮细胞损伤的保护效应研究
[目的]研究依达拉奉对氧剥夺导致的IEC -6细胞株损伤的保护效应.[方法]将预先培养好的细胞分为3组:正常组(N组),氧剥夺组(OGD,IR组)和依达拉奉治疗组(OGD+依达拉奉,E组).本研究中所用氧剥夺模型是将细胞株换无糖无血清的培养基后放入含5％ CO2和95％N2的密闭培养箱中2h,后重新复氧复糖.在复氧复糖的同时,将依达拉奉盐溶液( 10 mg/mL)加入细胞培养基中.在复氧复糖2h,收集细胞用DHE荧光探针进行氧自由基(ROS)测定;伤后12 h,富集细胞用于超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的测定;伤后24h收集细胞,用流式细胞仪测定细胞凋亡和Alamar Blue测定细胞活力.[结果]DHE荧光探针结果显示OGD导致的ROS,E组比IR组减少:OGD刺激后,IEC -6细胞内的MDA浓度上升为(1.52±0.21) mmol/mg,而E组的含量为(1.21±0.16) mmol/mg,P＜0.05.OGD后,IEC -6细胞内的SOD活力下降至(7.35±0.84) U/mg,而E组的SOD活力为(8.25±1.12) U/mg,P＜0.05.OGD后细胞活力下降为0.48±0.081,而E组的细胞活力为0.56±0.049,P＜0.01.同时,流式细胞仪的结果显示,依这拉奉抑制了OGD导致的细胞过度凋亡.[结论]依这拉奉可以减轻OGD造成的IEC -6细胞的损伤.
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参苓白术散调节ROCK/MLCK信号通路抗IBD的作用机制
目的 探讨参苓白术散抗脂多糖(LPS)诱导的炎症性肠病(IBD)损伤的作用和机制.方法 采用LPS(200μg·mL-1)造模,将细胞分为空白组(10%空白血清),模型组(10%空白血清+LPS),参苓白术散低、中、高剂量组(4%含药血清+LPS、8%含药血清+LPS、16%含药血清+LPS),FBS对照组(10%FBS+LPS)、Rho激酶(ROCK)阻断剂Y27632组(10μmol·L-1 Y27632+16%含药血清+LPS)、肌球蛋白亲链激酶(MLCK)阻断剂ML-7组(10μmol·L-1 ML-7+16%含药血清+LPS).建立肠隐窝上皮细胞(IEC-6)与小鼠T淋巴细胞瘤细胞(Cyc-Tag)共培养体系.将共培养细胞接种于Transwell 12孔板中,采用Millipore-ERS电阻仪检测共培养体系下IEC-6细胞跨膜电阻值(TEER);采用Western Blotting法分别检测共培养体系中和Cyc-Tag单独培养下ROCK、MLCK、 磷酸化ROCK(Pho-ROCK)及磷酸化MLC(Pho-MLC)蛋白的表达情况.结果 共培养体系中,与空白组比较,模型组的IEC-6细胞TEER值显著下降(P<0.01),ROCK、Pho-ROCK、MLCK及Pho-MLC蛋白表达量显著增加(P<0.01);与模型组比较,参苓白术散低、中、高剂量组及Y27632组、ML-7组的IEC-6细胞TEER值均显著升高(P<0.01),ROCK、Pho-ROCK、MLCK及Pho-MLC蛋白表达量均有明显下调(P<0.05,P<0.01).Cyc-Tag细胞单独培养下,与空白组比较,模型组的ROCK、Pho-ROCK、MLCK及Pho-MLC蛋白表达量显著增加(P<0.01);与模型组比较,参苓白术散低、中、高剂量组及Y27632组、ML-7组的ROCK、Pho-ROCK、MLCK及Pho-MLC蛋白表达量均有明显的下调(P<0.05,P<0.01).结论 参苓白术散含药血清对LPS诱导的IEC-6细胞损伤具有明显地抑制作用,可能与调节ROCK/MLCK信号通路及改善IEC-6细胞通透性有关.
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肠隐窝上皮细胞Myd88稳定沉默体外模型的建立及早期凋亡研究
肠道炎症性疾病临床常见,发病率逐年上升而病因不清.现已证实Toll样受体4(TLR4)信号通路与肠道炎性疾病密切相关.髓样分化蛋白88(Myd88)是TLR4炎症信号通路上游关键调控点,对肠道炎性疾病的研究具有重要价值,但目前尚缺乏Myd88稳定调控表达的体外模型.本实验利用慢病毒三质粒包装系统,构建特异靶向Myd88基因RNA干扰(RNAi)病毒载体.采用改良病毒离心法结合离心孵育法(MVC-S)行肠隐窝上皮细胞(IEC-6)转导,采用Real-time PCR及Western blot检测Myd88 mRNA及蛋白水平,Annexin V染色、流式细胞术检测Myd88沉默后对IEC-6细胞早期凋亡影响.结果显示正确构建的慢病毒shRNA载体,可通过改良MVC-S法成功转导IEC-6细胞,转导后的IEC-6细胞Myd88表达明显下调,同时早期凋亡减少.本实验成功构建了慢病毒载体介导的RNAi的Myd88稳定沉默细胞系,并总结分享了实验中的关键技术条件及要点,同时描述了沉默Myd88后IEC-6细胞早期凋亡明显减少的特征,为肠道炎性疾病的发病机制及靶向治疗研究提供了一个新的、稳定的、可重复的细胞模型.
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角质细胞生长因子联合低氧诱导因子1α对低氧应激大鼠小肠隐窝上皮细胞的保护作用及其机制
目的 探讨角质细胞生长因子(KGF)联合低氧诱导因子1α(HIF-1α)对低氧应激大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)的保护作用及其机制. 方法 (1)取常规培养大鼠IEC-6细胞,根据随机数字表法分为常氧空白组、常氧KGF组、常氧HIF-1α组和常氧联合组,分别更换DMEM培养基、含0.5 ng/mL KGF培养基、含10.0 ng/mL HIF-1α培养基及同时含0.5 ng/mL KGF和30.0 ng/mL HIF-1α培养基,放入氧气体积分数为21％的细胞培养箱培养24 h.(2)另取常规培养大鼠IEC-6细胞,根据随机数字表法分为常氧对照组、低氧对照组、低氧KGF组、低氧HIF-1α组及低氧联合组.常氧对照组细胞更换DMEM培养基,并常规培养24 h;低氧对照组、低氧KGF组、低氧HIF-1α组及低氧联合组细胞分别更换DMEM培养基、含0.5 ng/mL KGF培养基、含10.0 ng/mL HIF-1α培养基及同时含0.5 ng/mL KGF和30.0 ng/mL HIF-1α培养基,并置于氧气体积分数为5％的三气培养箱中低氧培养24 h.取常氧及低氧处理各组细胞,样本数为3,光学显微镜下观察细胞形态学变化.取常氧及低氧处理各组细胞,样本数为3,细胞计数试剂盒8检测细胞存活率.取常氧对照及低氧处理各组细胞,样本数为3,流式细胞仪检测细胞周期变化及凋亡水平,紫外分光光度计和蛋白质印迹法分别检测细胞ATP含量和p53蛋白表达水平.对数据行单因素方差分析及LSD检验. 结果 (1)培养24 h后,常氧处理各组细胞均生长良好,细胞呈圆形或椭圆形,胞质清晰;低氧处理各组细胞均出现梭形、星形等不规则形态,胞质有黑色颗粒沉着.(2)培养24 h后,常氧空白组、常氧KGF组、常氧HIF-1α组及常氧联合组细胞存活率分别为(107.4±8.7)％、(109.8±2.9)％、(115.8±7.4)％、(112.8±10.6)％,组间总体比较,差异无统计学意义(F =0.685,P=0.586).培养24 h后,低氧对照组、低氧KGF组、低氧HIF-1α组及低氧联合组细胞存活率分别为(35.1±4.6)％、(52.9±6.8)％、(56.2±3.1)％、(71.2±9.6)％,均显著低于常氧对照组的(106.3±12.3)％,P＜0.001.低氧KGF组、低氧HIF-1α组及低氧联合组细胞存活率均明显高于低氧对照组(P=0.023、0.009、＜0.001),低氧联合组细胞存活率明显高于低氧KGF组和低氧HIF-1α组(P=0.017、0.045).(3)培养24 h后,低氧对照组G1期细胞百分比显著高于常氧对照组(P=0.030),低氧对照组、低氧KGF组、低氧HIF-1α组S期细胞百分比显著低于常氧对照组(P =0.020、0.031、0.026),其余各组各期细胞百分比与常氧对照组相近(P =0.516、0.107、0.052、0.985、0.637、0.465、0.314、0.591).培养24 h后,低氧对照组、低氧KGF组及低氧HIF-1α组G1期细胞百分比明显高于低氧联合组(P=0.001、0.030、0.014),且S期细胞百分比显著低于低氧联合组(P=0.001、0.012、0.010).(4)培养24 h后,与常氧对照组比较,低氧对照组细胞凋亡率明显升高(P =0.018),低氧联合组细胞凋亡率明显降低(P=0.008).培养24 h后,与低氧对照组比较,低氧KGF组和低氧联合组细胞凋亡率明显降低(P=0.004、0.001);低氧联合组细胞凋亡率明显低于低氧KGF组和低氧HIF-1α组(P=0.032、0.002).(5)培养24 h后,与常氧对照组比较,低氧联合组细胞ATP含量无明显变化(P=0.209),其余各组细胞ATP含量均明显降低(P=＜0.001、0.001、0.002);与低氧对照组比较,低氧HIF-1α组和低氧联合组细胞ATP含量明显升高(P=0.044、0.001);低氧联合组细胞ATP含量明显高于低氧KGF组和低氧HIF-1α组(P=0.011、0.020).(6)培养24 h后,与常氧对照组比较,低氧对照组、低氧KGF组、低氧HIF-1α组细胞p53蛋白表达量明显升高(P＜0.001),低氧联合组细胞p53蛋白表达量显著低于低氧对照组、低氧KGF组和低氧HIF-1α组(P=0.001、0.001、0.002). 结论 KGF联合HIF-1α对低氧应激大鼠IEC-6细胞具有显著的保护作用,可通过降低其细胞周期阻滞程度及凋亡水平,提高细胞的能量代谢水平,从而促进低氧环境下细胞的存活.
