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转录抑制因子Bmi-1基因正、反义真核表达载体的构建及鉴定
[目的]克隆转录抑制因子Bmi-1基因并构建其正、反义真核表达载体,为研究其功能及其作用机制奠定基础.[方法]根据Bmi-1基因已知序列,设计合成一对引物,上下游引物分别加入XhoI和ClaI的酶切位点,用反转录PCR(RT-PCR)方法从人红白血病细胞株(K562)总RNA中扩增编码Bmi-1的基因片段(1017 bp),插入克隆载体pMD18-T,构建pMD18-Bmi-1载体,经限制性核酸内切酶谱证实后,再克隆至逆转录病毒载体pLNCX2中,构建pLNCX2-Bmi-1真核表达栽体,并经测序证实.然后以pLNCX2-Bmi-1为模板,物扩增Bmi-1基因起始密码子及编码锌指结构区域上下171 bp长度的核苷酸片段,并反向连接于表达载体(pLNCX2)上.[结果]DNA测序表明编码序列与读框完全正确,RT-PCR扩增出和目的片段相同的片段,正义DNA片断长度为1029 bp.反义片断长度为171 bp,Bmi-1基因被成功扩增并被克隆至真核表达载体pMD18-T和pLNCX2中.[结论]Bmi-1正义及反义片断被成功扩增,并成功构建了Bmi-1正、反义重组真核表达栽体,为进一步研究该基因打下了基础.
