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强力霉素对糖尿病小鼠肌肉转染人胰岛素因的调控作用
[目的]研究强力霉素对糖尿病小鼠肌肉转染人胰岛素基因表达的调控作用.[方法]构建prTA - tet4 -rhINS质粒;以链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导昆明小鼠成糖尿病模型.采用电穿孔法转移质粒prTA - tet4 -rhINS,通过强力霉素(doxcycline,Dox)水给药/撤除以评价四环素系统调控人胰岛素表达的可行性.检测末梢血糖,血清人真胰岛素及小鼠肌肉组织人胰岛素原基因mRNA表达情况.[结果]电穿孔转染目的质粒胰岛素后,立即予饮Dox水,可在小鼠肌肉组织中检测到mRNA表达,第2周降糖效果佳,撤除强力霉素后,血糖回升,于48 h升至转染前水平,再次予饮Dox水后,血糖逐渐下降,72 h内达到撤药前水平.重复给药/撤药两次结果一致.[结论]通过给药/撤除Dox可以实现对人胰岛素原基因表达的开关调控.
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四环素调控系统对白喉毒素-血管内皮细胞生长因子融合基因表达的影响
目的:研究四环素调控系统对DT390-VEGF165融合基因在人胃癌细胞中表达的影响.方法:构建四环素调控的DT390-VEGF165融合基因真核表达载体,用脂质体介导转染胃癌细胞SGC7901,在四环素有或无的情况下检测胃癌细胞的存活率.结果:4μg构建物转染5×105个胃癌细胞/孔(24孔板)96h后发现,无四环素时转毒素融合基因的细胞的存活率为20%:四环素存在时转毒素融合基因的细胞的存活率为66%;转染细胞在四环素有或无的情况下经白喉抗毒素-FITC免疫荧光抗体染色均呈现黄绿色荧光,表明融合基因在细胞中得到了表达,且四环素调控系统存在基础量的漏表达.结论:四环素调控系统基本上可以控制毒素基因在人胃癌细胞中的表达.
关键词： DT390-VEGF165融合基因 四环素调控系统 胃肿瘤 基因治疗 -
在HepG2细胞系上建立四环素(Tet-On)基因调控系统表达P450 2E1
目的在HepG2细胞系上建立四环素(Tet-On)基因调控系统,调控表达P450 2E1 (CYP2E1).方法先后转导调控蛋白基因及CYP2E1 cDNA(已与四环素反应启动子整合)入HepG2细胞.用多西环素调控CYP2E1的表达,用RT-PCR和Westernblot检测其表达高低.结果 RT-PCR和Westernblot均检测出CYP2E1被多西环素调控表达.结论四环素(Tet-On)基因调控系统(表达CYP2E1)已在 HepG2细胞系上成功建立.
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四环素对EPO基因表达的调控研究
目的 探讨四环素调控系统对重组人促红细胞生成素基因表达的调控.方法 将pTRE2hyg-EPO及Tet-On质粒转导入SD大鼠骨骼肌细胞,用RT-PCR、Western印迹实验及红系集落生成实验检测hEPO基因在大鼠骨骼肌内的表达和蛋白的活性,并观察四环素系统对EPO表达的调控作用.结果 重组人EPO基因可以在大鼠骨骼肌原代细胞中表达,并受四环素调控系统的控制,并与诱导药物剂量成正比.生成的促红细胞生成素具有生物活性,可明显刺激骨髓红系细胞的生长.结论 在细胞水平四环素调控系统可控制转导的EPO基因的表达,并且生成有生物活性的促红细胞生成素,达到基因治疗的要求.
关键词： 重组人促红细胞生成素基因 四环素调控系统 基因治疗 -
四环素调控的介导bFGF重组腺相关病毒的构建及体外实验
目的:制备携带碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的病毒载体,能被四环素调控表达.方法:构建重组质粒pAAV-S3-bFGF,生产重组病毒rAAV2-tet-off-bFGF,并感染小鼠颅骨前成骨细胞MC3T3-E1,实时定量PCR检测强力霉素(doxycycline,Dox)调控下rAAV2-tet-off-bFGF对MC3T3-E1中成骨相关因子的影响.结果:生产出高滴度及纯度的重组病毒rAAV2-tet-off-bFGF,能被Dox调控,感染MC3T3-E1后能促进胞内成骨相关因子的表达升高.结论:这种重组病毒rAAV2-tet-off-bFGF能在Dox调控下有效传递外源基因,为骨组织工程中的种子细胞提供基因传递载体.
关键词： 腺相关病毒 基因传递 碱性成纤维细胞生长因子 四环素调控系统 -
DNA载体介导的小干扰RNA Tet-on基因表达系统的调控效应检测
目的 观察构建的DNA载体介导的小干扰RNA Tet-on基因表达系统的调控效应.方法 构建DNA载体介导的小干扰RNA(siRNA)Tet-on表达载体,pDIRS4.1 siRNA.以增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因和白细胞介素6(IL-6)基因为目的基因,应用脂质体介导的瞬时转染方法,分别将pDIRS4.1/EGFP siRNA载体和pEGFP-N3质粒、pDIRS4.1IL-6 siRNA载体和pIRESIL-6质粒共转染人成骨肉瘤细胞,加入系列浓度的四环素(Dox)后,观察其诱导效应.结果 pDIRS4.1 siRNA在人成骨肉瘤细胞中能够高效转染;随着Dox浓度升高,pDIRS4.1 siRNA载体在人成骨肉瘤细胞中对目的基因的沉默作用有较好的调控性,且目的基因的表达与Dox具有严格的剂量依赖关系,高浓度Dox时,IL-6表达水平降低约12倍.结论 该研究构建的以DNA载体介导的能够高效调控siRNA沉默基因效应的Tet-On基因表达系统,能够促进其在更多模型系统中进行基因功能研究的应用.
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肝脏特异性可调控丙型肝炎病毒核心蛋白表达的转基因小鼠模型的建立
[目的]制备TRE-HCV-C转基因小鼠,为四环素调控系统的体内研究提供了反应部分的转基因小鼠,以便与本实验室同时建立的调控部分的小鼠共同作用,为进一步建立双转基因小鼠模型奠定基础,更为丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-C)的发病机制的研究提供一个实用方便的模型.[方法]重组构建含有目的基因HCV-C、TRE序列和SV40 polyA的转基因载体pTRE-HCV-C,以显微注射的方法将1.153 kb的转基因片段注入BALB/C母鼠的受精卵,出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性,再经Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定.用转基因阳性小鼠和整合有肝脏特异性启动子ApoE和rtTA基因的另一品系转基因小鼠杂交,得到子代F1小鼠,通过免疫组织化学来初步检测HCV-C在肝脏中特异性的可调控性的表达.[结果]产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首建鼠,以及它的子代也带有此基因.与基因组上整合有肝脏特异性启动子ApoE和rtTA基因的转基因小鼠杂交后,得到子代F1小鼠,特定时间与DOX作用后,小鼠肝脏的免疫组织化学结果表明,TRE-HCV-C小鼠为丙型肝炎病毒核心蛋白的发病机制研究提供了一个良好的动物模型工具.[结论]成功制备了HCV-C转基因小鼠,可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用,为进一步建立四环素调控系统调控下表达HCV-C基因双转基因小鼠模型奠定基础,也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具.
关键词： HCV-C 丙型肝炎病毒核心蛋白 转基因小鼠模型 四环素调控系统 组织特异性表达 -
tTS/rtTA系统下调目的基因基础表达的细胞模型研究
[目的]构建带有肝脏特异性启动子和tTS沉默子的四环素调控系统,观察其在人HepG2细胞内的表达,建立严密型四环素调控系统的HepG2细胞模型.[方法]通过二次分子克隆构建重组真核表达质粒载体pliv7-rtTA-tTS-Neo,用脂质体法将质粒pliv7-rtTA-tTS-Neo及pliv7-rtTA-Neo转染人HepG2细胞,经G418筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化,克隆扩增后瞬时转染pTRE-Luc质粒,强力霉素(1 mg/L)诱导表达后检测荧光素酶活性,挑选出低背景和高诱导表达的HepG2细胞克隆.[结果]带有tTS的细胞株其诱导倍数明显高于不带有tTS的细胞株(192:21),其中克隆9的诱导倍数高(256),获得1株高表达、低背景的HepG2/pLiv7-rtTA-tTS-Neo细胞株.[结论]荧光素酶活性检测结果验证了tTS对四环素调控系统的内在泄露问题有一定的抑制作用,使四环素调控系统的开关具有真正意义上的严密性.
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四环素调控促红细胞生成素基因转导骨骼肌细胞治疗肾性贫血的研究
目的:克隆、构建、鉴定重组人促红细胞生成素(rhEPO)基因四环素调控真核表达载体;探讨四环素系统对rhEPO基因表达的调控.方法:以含rhEPO全长cDNA的CHO细胞为模板,通过RT-PCR方法扩增出rhEPO基因,将其克隆到真核表达载体pTRE2hyg的多克隆位点,构建成pTRE2hyyg-EPO,进行酶切及测序鉴定.将pTRE2hyg-EPO及Tet-On质粒转导入SD大鼠骨骼肌细胞,用RT-PCR、Western印迹实验和半固体细胞培养实验检测rhEPO基因在大鼠骨骼肌内的表达和蛋白的活性,并观察四环素系统对EPO表达的调控作用.结果:(1)成功构建了四环素调控真核表达质粒pTRE2hyg-EPO,经测序鉴定与所需EPO基因序列一致.(2)rhEPO基因可以在大鼠骨骼肌原代细胞中表达,并受四环素调控系统的控制.生成的EPO具有生物活性,可明显刺激骨髓红系细胞的生长.结论:在细胞水平四环素系统可控制转导的EPO基因的表达,并且生成有生物活性的EPO,达到基因治疗的要求.
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四环素调控系统对乙型肝炎病毒核心启动子活性及组织特异性的影响
目的:分析四环素调控系统对乙型肝炎病毒核心启动子(Cp)活性及组织特异性的影响.方法:利用PCR从质粒pTL-8扩增7个Teto序列,并将其克隆入T载体pMD19-T Simple中.测序正确后将7个Teto序列亚克隆入pGL3-Basic/Cp荧光素酶报告基因质粒中Cp启动子的上游,以构建质粒pGL3-Basic/7t/Cp.将能表达TetR的质粒pTL-8的荧光素酶编码基因切除后,与pGL3-Basic/7t/Cp共转染肝癌细胞系HepG2,宫颈癌细胞系HeLa,绿猴肾细胞系COS-7,乳腺癌细胞系MDA-MB-231和结肠癌细胞系HT-29,通过双荧光素酶检测系统检测荧光素酶在这些不同细胞系中的活性,以鉴定四环素调控系统对Cp活性及组织特异性的影响.结果:成功构建了质粒pGL3-Basic/7t/Cp,将其转染入不同组织来源的细胞系后表明将7个teto序列克隆入Cp上游后增强了Cp在各细胞系中的活性.结论:四环素调控系统明显增强了Cp的转录活性.但同时,Cp失去了其组织特异性的特点,即在这些细胞系中均有较强活性.
