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LC/MS/MS法同时测定细胞孵化液中6种雌激素类化合物的含量
目的 建立同时测定细胞孵化液中6种雌激素类化合物含量的LC/MS/MS法,并用该法研究ELS在乳腺癌细胞中的代谢行为.方法 细胞孵化样品经处理后,采用Diamonsil C18柱分离,流动相为乙腈和5 mmol· L-1醋酸铵(pH 7.8),梯度洗脱,采用电喷雾电离(electrospray ionization,ESl)源,以多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)方式进行检测,用于定量分析的离子反应分别为m/z 269.3→m/z 145.2(雌酮,estrone,E1),m/z 271.1→m/z 145.2(雌二醇,estradiol,E2),m/z 349.2→m/z 269.2(硫酸雌酮,estrone-3 -sulfate,E1S),m/z 351.1→m/2 271.3(硫酸雌二醇,estradiol-3 sulfate,E2S),m/z 445.5→m/z 269.3(β-D-葡萄糖醛酸雌酮,estrone-3-glucuronide,ELG),m/z 447.4→m/z 271.0(葡萄糖醛酸雌二醇,estradiol-3 -glucuronide,E2G)和m/z 253.4→m/z223.0(大豆苷元,内标).结果 该方法中E1、E2、E1S、E2S的线性分别为9.8～5 000.0 nmol·L-1,E1G、E2G的线性为0.98 ～500.00 nmol.L-1；日内和日间精密度均小于10.8％,相对误差在±11.7％以内.结论 该法适用于细胞孵化液中6种雌激素类化合物的同时测定.
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反义寡核苷酸阻断乳腺癌细胞中葡萄糖神经酰胺合成酶的表达和意义
目的 探讨靶向葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase,GCS)的基因试剂MBO-asGCS逆转乳腺癌多药耐药的作用机制及其意义.方法 MBO-asGCS处理体外培养的人乳腺癌细胞MCF-7及其耐药型MCF-7/AdrR,采用细胞毒性分析测定MBO-asGCS对MCF-7-AdrR存活率的影响,RT-PCR和Western印迹分析对耐药型细胞GCS的表达变化,检测对caspase 3/7的活性影响及流式细胞仪测定MBO-asGCS对耐药型细胞的凋亡情况.结果 MBO-asGCS转染人耐药型乳腺癌细胞MCF-7/AdrR后,与未转染组细胞的IC50分别是0.18 μmol/L和12.50 μmol/L,药物敏感性提高了69倍;MBO-asGCS抑制GCS的mRNA表达70%,减少GCS蛋白表达39%(P<0.01);转染MBO-asGCS后耐药型细胞的caspase 3/7活性上升53%(P<0.05),细胞凋亡率上升5.6倍(P<0.01).结论 GCS过表达是耐药型乳腺癌细胞的特征,靶向人GCS的反义寡核苷酸可直接抑制GCS的过表达,诱导耐药细胞凋亡,有效逆转其耐药性,GCS可能是治疗耐药型乳腺癌的一个潜在靶点.
关键词： 乳腺肿瘤细胞 反义寡核苷酸 葡萄糖神经酰胺合成酶 药物耐药 -
microRNA-374b抑制乳腺恶性肿瘤细胞增殖和转移的作用机制
目的 探讨microRNA-374b抑制乳腺恶性肿瘤细胞增殖和转移的作用机制.方法 构建microRNA-374b过表达的稳转MDA-MB-231细胞和空载MDA-MB-231细胞.通过MTS细胞增殖实验、单克隆形成实验、细胞划痕实验和细胞凋亡检测,计算细胞增殖相对数、划痕修复百分比和细胞凋亡百分比.通过microRNAs专业网站的预测筛选和双荧光素实验分析其可能的下游基因.采用实时定量PCR检测乳腺癌组织和癌周组织中人单核粒细胞趋化因子(MCP)-1和microRNA-374b含量.结果 乳腺癌组织中的microRNA-374b相对表达量为0.43±0.03,显著低于癌周组织中的1.15±0.04(P＜0.05).MDA-MB-231-2396细胞的microRNA-374b相对表达量为0.53±0.20,显著高于MDA-MB-231-NC细胞的0.18±0.02(P＜0.05).培养第5、7天时MDA-MB-231-2396细胞增殖相对数分别为9.00±0.74、16.06±0.23,显著低于MDA-MB-231-NC细胞的14.23±0.55、31.92±2.56(P值均＜0.05).MDA-MB-231-2396细胞结晶紫洗脱液的光密度值为0.54±0.02,显著低于MDA-MB-231-NC细胞的1.35±0.05 (P＜0.05).MDA-MB-231-2396细胞早期凋亡百分比为(44.92±1.56)％,显著高于MDA-MB-232-NC细胞的(2.60±0.04)％(P＜0.05).MDA-MB-231-2396细胞于培养16、24、48 h时的划痕修复百分比分别为(13.27±5.72)％、(18.25±8.43)％、(28.22±9.46)％,均显著低于MDA-MB-232-NC细胞的(25.48±0.53)％、(47.35％±1.40)％、(80.23±2.61)％(P值均＜0.05).双荧光素实验结果显示,MCP-1 3'UTR野生型与microRNA-374b类似物组合转染入293T细胞后两种荧光素的比例显著低于MCP-1 3'UTR突变型与microRNA-374b类似物组合(P＜0.05),MCP-1 3'UTR野生型与microRNA-374b抑制物组合转染入293T细胞后两种荧光素的比例显著高于MCP-1 3'UTR突变型分别与microRNA抑制物的对照物、microRNA-374b、microRNA-374b类似物的对照物组合(P值均＜0.05).乳腺癌组织中MCP-1的相对表达量为5.79±1.32,显著高于癌周组织的0.07±0.01(P＜0.05).结论 microRNA-374b可通过抑制MCP-1的表达来抑制乳腺恶性肿瘤细胞的增殖和转移能力,并促进其凋亡.
关键词： microRNA-374b 人单核细胞趋化蛋白-1 乳腺肿瘤细胞 增殖 转移 -
紫杉醇联合阿霉素方案(TA)对乳腺肿瘤细胞的抑制作用分析
目的 对紫杉醇与阿霉素联合应用于抑制乳腺肿瘤细胞的临床疗效分析.方法 选取在我院接受治疗的78例乳腺肿瘤患者,入院时间为2016年5月～2017年5月.将其根据随机数字表法平均分为试验组和对照组,每组患者39例.给予试验组患者行紫杉醇与阿霉素联合治疗,给予对照组患者行5-Fu、氨甲喋呤以及环磷酰胺联合治疗.对比分析两组治疗方法对肿瘤细胞的抑制情况.结果 试验组患者用药后的总有效率(92.31％)明显高于对照组患者用药后的总有效率(56.41％),差别有统计学意义(P<0.05).结论 将紫杉醇与阿霉素联合应用于乳腺肿瘤患者的治疗中,可显著抑制肿瘤细胞的增长,有较高的临床应用价值.
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蛋白酪氨酸磷酸化水平与乳腺癌细胞株抗失巢凋亡特性的关系
背景与目的:正常上皮或内皮细胞脱离与细胞外基质的联系时会发生失巢凋亡(anoikis),而大多数来源于上皮或内皮的肿瘤细胞则丧失了这种特性,多数相关研究表明肿瘤细胞的抗失巢凋失特性与细胞信号转导的异常密切相关.本研究初步探讨信号分子的蛋白酪氨酸磷酸化水平与肿瘤细胞抗失巢凋亡特性之间的关系.方法:用琼脂糖凝胶电泳检测DNA梯状带,用流式细胞术以及软琼脂集落形成实验等方法观察正常狗肾脏上皮细胞株MDCK(Madin-Darby canine kidney)和3种乳腺癌细胞株MCF-7、Bcap-37以及MDA-MB-231的抗失巢凋亡特性.同时分析广谱蛋白酪氨酸激酶抑制剂染料木黄酮(genistein)对肿瘤细胞这种特性的抑制作用,并通过Western blot检测3种乳腺癌细胞在悬浮培养与贴壁培养时总体蛋白酪氨酸磷酸化水平的差异.结果:3种乳腺癌细胞均表现出明显的抗失巢凋亡特性,进一步的研究证明这种特性可被染料木黄酮所抑制.Western blot的结果显示与贴壁培养时相比,在悬浮培养的MDCK细胞中所有的蛋白酪氨酸的磷酸化水平均呈现下降趋势;而在肿瘤细胞中,尽管大多数蛋白质酪氨酸的磷酸化水平下降,但是可见有酪氨酸磷酸化水平异常增高的蛋白条带(幅度3.5～6.5倍).结论:3种乳腺癌细胞均具有不同程度的抗失巢凋亡特性,而信号蛋白酪氨酸的异常磷酸化与这些肿瘤细胞的抗失巢凋亡特性有关.
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乳腺导管癌中微浸润癌细胞免疫病理学分析
目的 探讨乳腺导管癌中微浸润癌细胞的免疫学性质和病理形态学特征.方法 采用双重免疫组织化学染色的方法,对50例微浸润乳腺导管癌进行肿瘤侵袭、抑制凋亡等相关因子分别与SMA的双重染色,阐述微浸润癌细胞的免疫学及病理形态特征.结果 微浸润癌细胞缺乏肿瘤侵袭相关指标MMP-9、TIMP-1的表达,也缺乏抑癌基因p16和抑制凋亡因子Bcl-2的表达,但它们却高表达原癌基因c-erb-B2.微浸润癌细胞大多呈浓缩、深染的卵圆形、不规则形或长梭形核,排列密集,呈锥形或舌形侵入基质.结论 微浸润癌细胞的免疫学和病理形态学特征,提示这部分癌细胞为分化程度较低的原始或幼稚细胞,并具有较强的潜在增殖和浸润能力,为乳腺微浸润癌的早期诊断提供免疫学和形态学依据.
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MCP-1在乳腺恶性肿瘤细胞增殖与转移中的作用
目的 探讨人单核细胞趋化因子-1(MCP-1)在乳腺恶性肿瘤细胞增殖转移中的作用.方法 构建MCP-1过表达的稳转人乳腺癌细胞MCF-7细胞和空载MCF-7细胞,分别标记为MCP-1过表达MCF-7细胞(MCP-MCF-7)、空载MCF-7细胞(EV-MCF-7).通过CCK8细胞增殖实验、单克隆形成实验、划痕实验和细胞凋亡检测,观察MCP-1过表达对细胞增殖转移及凋亡的影响.通过real-time PCR法检测MCP-1可能的下游基因.结果 成功构建了MCP-1过表达MCF-7乳腺癌细胞株及对照细胞株.CCK8实验显示培养第5天起MCP-MCF-7细胞株在450 nm处的吸光度明显高于EV-MCF-7组,且差异有统计学意义(P<0.05).细胞集落形成实验提示MCP-MCF-7细胞株所形成的集落数量明显多于EV-MCF-7细胞,差异有统计学意义(P<0.05),且前者单个集落的体积亦大于后者.划痕实验中12 h后MCP-MCF-7细胞的迁移能力开始增强,到48 h时划痕更加愈合明显.虽然转染MCP-1后细胞有效凋亡百分比(0.57%)低于空载细胞(1.10%),但差异无统计学意义(P>0.05),即MCP-1对MCF-7乳腺癌细胞凋亡无影响.在对MCP-1下游可能基因的分析结果提示MCP-1可以上调p65、MMP2、STAT2基因表达,下调RASSF1基因表达.结论 MCP-1具有直接促进乳腺恶性肿瘤细胞的增殖和转移能力,且此种作用可能与p65、MMP2、STAT2、RASSF1有关.
关键词： 人单核细胞趋化蛋白-1 乳腺肿瘤细胞 增殖 转移 -
转录因子S tat5a对乳腺癌细胞增殖的影响及其表观遗传学机制探讨
目的：探讨转录因子Stat5a对人类乳腺癌细胞（MCF‐7）增殖的影响及表观遗传学机制。方法利用腺病毒介导的基因转移技术，使MCF‐7大量表达转录因子Stat5a ，应用活细胞计数（M TS）法检测细胞增殖情况，并以染色质免疫共沉淀（ChIP）方法，检测p53基因启动子区域组蛋白甲基化程度。后以实时定量 PCR进一步确认 p53基因表达水平。结果携带Stat5a cDNA的腺病毒感染后，MCF‐7的数量呈剂量依赖式地增加。当病毒感染增殖活性（MOI）分别为10、20及30时，MCF‐7的细胞密度较对照组细胞分别增加7．6031％、18．1237％及24．8987％。染色质免疫共沉淀分析表明，Stat5a明显导致p53基因启动子区域组蛋白甲基化（H3K27Me3）增加，p53基因表达水平下降。结论 Stat5a导致MCF‐7抑癌基因p53启动子组蛋白甲基化，使启动子活性降低，导致细胞的异常增殖。
关键词： 转录因子Stat5a 乳腺肿瘤细胞 表观遗传学 组蛋白甲基化 染色质免疫共沉淀
