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hRNF6基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位
目的 构建环指蛋白6(RNF6)真核表达栽体,并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 提取工具细胞HEK-293的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增hRNF6全长编码基因,并将其克隆至pCDNA3.1-myc-his A及pEGFP-C1表达栽体中.将构建的重组质粒测序并转染到工具细胞HEK-293中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用共聚焦激光扫描显微镜观察DEGFP-RNF6在工具细胞CV-1和胃癌SGC-7901细胞内的定位.结果 hRNF6全长基因序列克隆到了真核表达载体pCDNA3.1-myc-his A和pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为2 058 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为78 kDa.pEGFP-RNF6在CV-1细胞和胃癌SGC-7901细胞内定位以细胞核为主,在细胞质内少量表达.结论 成功的构建了hRNF6全长基因真核表达载体,pEGFP-RNF6蛋白主要定位于胃癌细胞核内.
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环指蛋白6对胰岛素受体底物1泛素化作用的研究
目的：构建环指蛋白6（RNF6）真核表达载体，并探讨其对胰岛素受体底物1（IRS-1）的泛素化作用。方法以人cDNA为模板，PCR 扩增 RNF6全长编码基因，并将其克隆至载体质粒 pcDNA3．1-CHA 中，将重组质粒转染肝癌细胞株 HepG2，利用实时荧光定量 PCR（RT-PCR）、免疫印迹（Western blot）检测细胞内 IRS-1 mRNA 水平及其蛋白表达水平。结果携带RNF6目的基因的质粒转染 HepG2细胞48 h 后 IRS-1的 mRNA 表达水平降低，为对照组的69％，显著低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0．01）。结论RNF6引起 IRS-1的表达下调，这一泛素化过程可能导致胰岛素信号转导障碍。
