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重组亚型表达文献资料
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hβ-arrestin1重组蛋白不同亚型筛选及互作鉴定
目的 构建GST/β-arrestin1融合蛋白表达载体,筛选其不同亚型重组子,并诱导表达、纯化蛋白,初步进行蛋白亚型互作比较,为进一步功能研究提供实验基础.方法 提取人源细胞的mRNA,反转录为cDNA.用PCR法扩增hβ-arrestin1全长编码基因,通过SalI和NotI酶切位点将hβ-arrestin1全长定向插入pGEX-5X-1中,构建原核表达载体pGEX-5X- 1-β-arrestin1,并通过BglⅡ单酶切筛选A、B亚型,然后将重组质粒转入E.coliB L21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,用谷胱甘肽-琼脂耱珠亲和纯化表达的GST/β-arrestin1A、B,SDS-PAGE鉴定,互作实验比较亚型的结合能力.结果 酶切及测序结果证明,成功构建了β-arrestin1A、B原核表达载体,并通过SDS-PAGE证实:经IPTG诱导表达及亲和纯化,从转化重组质粒的BL21菌株中获得了融合蛋白GST/β-arrestin1A、B亚型,通过GST Pulldown初步比较了重组β-arrestin 1A、B蛋白亚型的结合能力.结论 成功构建pGEX-5X -1 -β-arrestin1A、B原核表达载体并确定了融合蛋白的诱导表达及纯化方法,且互作实验显示β-arrestin1A有较强的结合能力,为进一步研究β-arrestin1的生物学功能奠定了基础.
关键词： hβ-arrestin1 克隆 重组亚型表达 蛋白互作
